矿石中元素的定性和半定量分析（mGWAS解析青稞的高紫外适应机制）

编者按：2019年10月27日，《Molecular Plant》杂志在线发表了来自西藏农牧科学院Nyima Tashi课题组的题为“Genome-wide dissection of co-selected UV-B responsive pathways in the UV-Badaptation of qingke”的研究论文。该研究揭示了青稞适应高原中高水平的UV-B的代谢及基因基础。

mGWAS解析青稞的高紫外适应机制

研究背景

青稞又称“裸大麦”，是青藏高原地区主要粮食作物，为适应高原低氧高紫外的环境，青稞的驯化可能经过了人工选择和自然选择两种不同的过程。植物已发展出多种策略来抵抗UV-B辐射，其中最重要的策略之一就是产生以抗坏血酸，芥子酸酯和类黄酮为代表的抗氧化剂保护剂。抗坏血酸是一种有效的抗氧化剂，存在于所有光合作用的真核生物中，而类黄酮和芥子酸酯显示出清晰的植物物种特异性。尽管已经证明了苯丙烷类化合物在应对非生物/生物胁迫中的重要作用，但某些苯丙烷类化合物（如黄酮C-糖苷和芳族酚酰胺）的生物合成和调控途径仍需进一步研究。

研究内容

• 材料：196份青稞和大麦的成熟籽粒、五叶期叶片

• 平台：UPLC-MS/MS

• 文章思路

研究结果

1. 青稞和大麦的代谢谱分析

从196份青稞和大麦材料中得到了收获期的籽粒样品和五叶期的叶片样品，通过LC-MS / MS构建了青稞的代谢物数据库，共2059个代谢物信息，其中籽粒955个（已知283个），叶片中的1104个（已知357个），在两个组织中都检测到的234个（已知126个）（图1A）。籽粒和叶片中超过65％的代谢物的变异系数（CV）大于50％，表明它们在青稞和大麦中具有显著变异的表达模式。籽粒中的黄酮醇和花青素的CV最高，平均分别高达271.5％和241.5％，叶片中的甘油磷脂的CV最低，平均为35.6％。

图1. A：检测到的代谢物统计；B：代谢物PCA结果

基于代谢物聚类可将材料分为两个类别——大麦（Ⅰ）和青稞（Ⅱ和Ⅲ）（图1B），与大麦相比，青稞中98种已知代谢物（籽粒64种，叶片34种）显著积累，包括10种氨基酸衍生物、6种核苷酸衍生物、11种花色苷、32种黄酮和黄酮糖苷等，此外还有173种未知物质（图2A）。有意思的是98种已知物质中，77种是苯丙烷前体，中间体或衍生物（图2B）。

除了大麦栽培种外，还收集了非青藏高原地区的45种裸大麦，用于比较其和青稞的代谢差异，发现与这45种裸大麦相比，青稞籽粒和叶片中共观察到156种代谢产物显著升高。将这一结果与青稞和大麦之间的差异重叠分析，发现61种物质在青稞中显著积累，其中50种为苯丙烷相关物质。基于之前关于苯丙烷化合物在UV-B辐射中起作用的报道，可以合理推测这些显著积累的苯丙烷物质和青稞紫外适应相关。

图2. A：样本代谢物的聚类热图；B：苯丙烷类物质在青稞和大麦中的差异表达箱线图；C：UV-B处理后代谢物火山图；D：UV-B处理后差异物质KEGG富集分析气泡图

2. 青稞中诱导的代谢积累可能与抗紫外和耐寒相关

为了深入了解青稞在UV-B辐射下的代谢反应，随机选择了进化枝Ⅱ的两个青稞品种和进化枝Ⅲ的一种紫青棵作为处理材料，将青稞幼苗暴露于UV-B辐射下24h后进行代谢检测，找到了91个上调表达和95个下调表达的物质（图2C），其中含氮化合物显著上调。然而，青稞中的大多数黄酮类物质在UV-B辐射下却无明显变化。进一步KEGG富集分析表明，差异物质主要富集在精氨酸和脯氨酸的代谢、精氨酸的生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路（图2D），表明青稞接受长时间的UV-B辐射后，芳香族氨基酸、甘油磷脂、酚酰胺、香豆素可能是青稞的重要保护剂，其中除甘油磷脂外，其它都为苯丙烷途径物质。为了确定寒冷胁迫下的代谢反应，将青棵幼苗于冷胁迫24h进行代谢分析，发现冷胁迫后有81种物质上调，其中包括5种苯丙烷前体物质，37种苯丙烷和苯丙烷衍生物。

3. 青稞和大麦代谢的遗传基础研究

通过对196份材料进行重测序，后与籽粒的214种物质及叶片的201种物质进行mGWAS分析，分别得到4308个和3175个lead SNP，对应于920个和825个基因座。所有lead SNP均显示对遗传变异有较大效应，高达43.7%。类黄酮，酚酰胺，香豆素，奎宁酸盐，维生素，氨基酸等显示出了较多的SNP位点（图3A）。进一步研究89种苯丙烷（包括在青稞中特异积累的77种和UV-B处理后显著上调的12种）的GWAS结果， 发现了1638个重要的SNP与57种苯丙烷相关。另观察到了相同和不同类别代谢物的广泛映射关系，暗示青稞抗紫外主要是因为苯丙烷及其衍生物的遗传调控。

为了确定在驯化过程中潜在的大麦、青稞分化信号，通过比较大麦和青稞的全基因组，共发现272.6Mb基因组分化区域，分布于4、7和2号染色体。将上述57种代谢物的重要mGWAS基因座与分化区域重叠时，发现与49种代谢物有关的90个重要基因座位于分化区域，并且在青稞的125个先导SNP中发现了39种代谢产物的高水平性状等位基因，包括32种苯丙烷类和7个苯丙烷衍生物，这些结果表明在青稞的自然选择和人工驯化过程中都涉及了苯丙烷途径。然后，本研究通过寻找代谢相关基因位点编码的蛋白功能、与同源基因的聚类以及基因相关性分析在23个重要基因座中鉴定到了25个候选基因。

图3. A：青稞、大麦种子和叶片中不同代谢物GWAS定位曼哈顿图结果；B：青稞代谢物GWAS定位一些位点是在青稞大麦基因组的差异位点中；C-F：不同类别物质定位的位点在青稞中呈现显著富集

4. 类黄酮候选基因分析

黄酮类物质是植物中广为报道的“防晒霜”，在青稞中也发现了特异累积，表明它们在保护UV-B中起着不可或缺的作用。对于谷物中的花青素，例如花青素3-O-葡萄糖苷，发现两个主要相关的SNP（SNP2：501706734和SNP7：67565912），SNP7处的C等位基因增加其含量的影响力取决于SNP2处的T等位基因，进一步分析发现一个MYB和一个MYC转录因子被指定为协同调节青科籽粒中花青素3-O-葡萄糖苷积累的候选基因，这与报道的通过花青素调节花青素色素途径的模型相一致。除了花色素苷，本研究还基于mGWAS确定了28个重要的基因位点，用于控制戊糖基黄酮（芹菜素8-C-戊糖苷）的积累。其中，1号染色体上的SNP333748763与芹菜素8-C-戊糖苷的水平显着相关（图4A）。在此基因座中寻找候选UGT时，发现HVUL1H37998基因被注释为UDP依赖性糖基转移酶（图4A），其中包含定义植物二级产物糖基转移酶的共有序列（ PSPG）盒子。CGT系统发育树将OsCGT和ZmCGT以及HVUL7H03881聚类在一个子集中，将HVUL1H37998及其在水稻中的直系同源物Os06g18670，聚类在一个亚类中，表明HVUL1H3703和C7-ly分别利用UDP-戊糖苷和UDP-葡萄糖苷进行糖基化反应（图4B）。体外酶活验证表明HVUL1H37998和HVUL7H03881分别负责青稞中C-戊糖基黄酮和C-葡萄糖基黄酮的生物合成。为了研究负责芹菜素8-C-戊糖苷变异的遗传变异，对从39个选定的大麦/青稞中扩增的HVUL1H37998进行了重测序，并在启动子或编码区内寻找可能的功能多态性，发现11个同义/非同义SNP与芹菜素8-C-戊糖苷水平高度相关，进一步测试鉴定出四个非同义SNP可能与芹菜素8 C-戊糖苷天然变异的功能性多态性有关。

图4. A：芹菜素8-C-戊糖苷的mGWAS分析；B：CGT系统发育树；C-D：黄酮五碳糖CGT酶活体外试验；E-F：HvCGTpen自然变异位点; G-H：不同基因型体外活性差异及蛋白点突变结果

图5. A：N-阿魏酰酪胺的mGWAS分析；B：系统发育树；C：酶活体外验证蛋白功能；D-E：烟草瞬时转化验证；F：在紫外处理24h条件下基因的表达趋势；G：在紫外处理24h条件下通路3个物质的表达趋势

5. 阿魏酰酪胺酰基转移酶验证

除组成型过度积累的代谢物外，还研究了在青稞抗UV-B中表现出的最强诱导型代谢物芳族酚酰胺。研究发现酚酰胺（N-阿魏酰酪胺）的表达水平与位于4号染色体上的SNP 4：55652582之间有很强的相关性。HVUL4H14252位于该SNP的下游5Kb，表明该酰基转移酶是一个GWAS重要的候选对象（图5A，5B）。体外酶促测定表明， HVUL4H14252与酪胺一起显示出很强的酰基转移活性（图5C），HVUL4H14252在烟草中的瞬时表达导致烟草叶中阿魏酰酪胺和香豆酰酪胺含量显着升高（图5D，E）。这些结果表明，HVUL4H14252负责青稞中N-阿魏酰酪胺的生物合成。此外，还观察到HVUL4H00327，HVUL4H11714和HVUL4H14252均与青稞中N-阿魏酰酪胺的生物合成相关。

在研究青稞和大麦在UV-B辐射下的转录和代谢调控时，发现两个青稞品种中HVUL4H00327，HVUL4H11714和HVUL4H14252均过表达，而在24h UV-B照射后，两个大麦品种未发现明显变化（图5F）。对于N-阿魏酰基酪胺和其他两种芳香族酚酰胺（包括N-阿魏酰基色胺和N-阿魏酰基羟色胺）在青稞和大麦也观察到相似的表达模式（图5G）。

6. 酚酰胺生物合成的转录调控机制

除酪胺衍生的酚酰胺外，我们发现N-阿魏酰色胺也与两个主要基因座SNP 2：436021143和SNP 2：529111791密切相关（图6A）。SNP 2：436021143 位于HVUL2H04696上游748 Kb（图6B），编码MYB家族的转录因子，为研究该转录因子的作用，在烟草叶片中瞬时过表达HVUL2H04696，并进行了代谢物谱分析。在瞬时过表达植物中，羟基肉桂酰基酪胺、N-阿魏酰基5-羟色胺、腐胺和亚精胺缀合物的积累显着上调（图6C）。与酚酰胺的过度积累一致，烟草中的几个苯丙烷类上游基因表达量也显着增加（图6D）。进一步的研究表明，在酵母杂交试验中，HVUL2H04696可以直接与Hv4CL的启动子结合（图6E）。这些结果表明，HVUL2H04696作为MYB转录因子正调控青稞中芳香族和脂肪族酚酰胺的生物合成。SNP 2：529111791位于HVUL2H29914的上游3.1kb（BAHD酰基转移酶，图6A），为了测试HVUL2H29914的活性，在大肠杆菌中过表达该基因并检测了纯化的重组蛋白的酰基转移酶活性， HVUL2H29914不仅在存在胍丁胺的情况下产生了香豆酰胍胺，而且在反应产物中产生了阿魏酰色胺（图6F）。在短暂过量表达HVUL2H29914的烟叶中，还观察到了香豆酰胍胺（图6G）和阿魏酰色胺（图6H）的显着升高。这些结果表明，HVUL2H29914参与青稞中胍丁胺和色胺的衍生酚酰胺的生物合成。

图6. A-B：阿魏酰色胺GWAS定位到了一个MYB转录因子及酰基转移酶。C：对MYB转录因子进行烟草瞬时转化，发现该MYB能够显著上调整合酚胺通路物质；D：苯丙烷通路上游结构基因表达量上调；E：该MYB可以结合4-香豆酸辅酶A连接酶基因（4CL）的启动子

研究结论

本研究分析青稞种子和叶片代谢组，发现青稞能够组成型及诱导型的积累整个苯丙烷代谢通路进行抗紫外。利用196个品种SNP结合代谢物进行mGWAS，找到了这些抗紫外物质的遗传定位位点，且与大麦相比，我们发现这些位点在青稞中受到共选择。除了这些位点，我们进一步找到了苯丙烷通路相关的候选基因，并对其中一些基因进行了验证，包括黄酮戊糖苷转移酶CGT、阿魏酰酪胺合成的3个酰基转移酶及阿魏酰色胺及酚胺相关的MYB转录因子。该研究为青稞胁胁迫等农艺性状遗传改良提供了参考。

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