“我们专注于生物特异化学的研究，2018 年我们遗传编码了新的非天然氨基酸——氟硫酸盐-L-酪氨酸，其反应机理正是六价硫氟交换点击化学反应（SuFEx）[1] 。”加州大学旧金山分校教授王磊说。
图 | 加州大学旧金山分校教授王磊（来源：王磊）
近些年，王磊专注研究的生物特异化学与点击化学有共通之处，即都需要在温和条件下高效反应。然而，生物特异化学需要在复杂的细胞和生物体内进行，并实现对生物分子的高选择性，因此对反应活性和选择性有更严苛的要求。
目前，生物特异化学主要应用于相同或不同的生物大分子。研究者通过特殊的方法使这些大分子之间发生定点和特异的反应，进行精确的共价连接。这些反应可以在体外、活细胞内与活体动物体内进行。
比如，应用蛋白质和蛋白质之间的生物特异反应，科学家可以在细胞内抓捕并鉴别短暂和微弱的蛋白质相互作用，用来了解酶和底物的对应关系等[2]。
此外，科学家也可以利用这些特异反应制备新型的共价蛋白药物，实现更强的药效、提高药代性质和治疗指数、减少治疗剂量和给药频率以及降低抗药性等[3-4]。
王磊说：“最近，我们主要研究蛋白质与 RNA 以及蛋白质与糖的共价连接，也称作交联。这些分子在反应的过程中能够产生稳定和特异的共价连接，可以广泛地应用于基础生物学、合成生物学以及生物医药等领域。”
无论是蛋白质与 RNA，还是蛋白质与糖之间的交联，都有效利用了临近使能反应。临近使能反应作为一种通用技术，只在相互接触的生物分子之间发生，有效地避免了非特异的交联和可能带来的副作用。同时，接触带来的临近效应使得反应能够在生物兼容的温和条件下高效进行，适合在细胞内和活体生物内应用。
蛋白质与 RNA 的化学交联
近日，王磊课题组在 Nature Chemistry 杂志上发表了论文《可遗传编码的体内 RNA 化学交联》（Genetically encoded chemical crosslinking of RNA in vivo）[5]。
在本研究中，课题组将具有潜伏生物反应活性的非天然氨基酸基因编码到 RNA 结合蛋白质中，使其与 RNA 发生反应，并在体内验证了该方法的可行性，成功的演示出蛋白质与目标 RNA 的化学交联。第一作者为博士后孙维（现为美国弗吉尼亚理工大学助理教授）与博士后王南溪（现为南京中医药大学特聘教授）。
（来源：Nature Chemistry）
在蛋白质和 RNA 的精确交联过程中有许多技术创新之处。研究者利用上文提及的“临近使能反应”的独特性质，使潜伏生物反应活性的非天然氨基酸中相对惰性的官能团与 RNA 上的羟基在温和的生物兼容条件下高效反应，同时实现对 RNA 之中核苷酸的选择性。
相较于以往的分子连接技术，蛋白质与 RNA 交联的优势体现在：第一，所有 RNA 的核苷酸都能反应、没有偏向性；第二，不需要额外刺激就能激发反应，可以用于细胞内和动物体内；第三，具备单个氨基酸和单个核苷酸的高分辨率。
为验证蛋白质与目标 RNA 交联的可行性与胞内适用性，课题组将非天然氨基酸遗传编码到“RNA 结合蛋白质”中，使其在胞内表达。蛋白质即能在胞内共价结合其目标 RNA。结合后的蛋白-RNA 复合体可以被免疫沉淀出来，获得的 RNA 可以用标准方法进行鉴别，并能确定被交联的核苷酸。
为使该交联技术的可应用性得到扩展，研究者在蛋白质与 RNA 之间定点引入共价连接。这些共价连接可以稳定蛋白质-RNA 复合体，甚至改变其生物功能。
王磊说：“许多疾病都涉及到 RNA 结合蛋白质的突变。我们认为，非天然氨基酸与 RNA 的交联对分析这些疾病机理和创建新的治疗方法都会有所助益。”
蛋白质与糖的精确交联
除了开展蛋白质与 RNA 的精确交联实验，王磊课题组此前还首次实现了蛋白质和糖的精确交联[6]。
蛋白质和糖的相互作用在生物发育、癌症转移、病原体感染和免疫反应等多种生物过程中都发挥出了重要的作用。
（来源：Nature Chemistry）
在蛋白质和糖精确交联实验中，研究者将带有磺酰氟官能团的非天然氨基酸遗传编码到目标蛋白的一个位点上。当编码蛋白与糖结合的时候，磺酰氟就会与附近糖上的羟基发生邻近使能反应，形成特异的共价连接，把蛋白质和糖不可逆地交联起来。
在此过程中，主要难点有两个：一是糖的反应活性低，蛋白质要在生物兼容的温和条件下与糖反应难上加难；二是各种糖的反应官能团基本相同，某个单糖的选择性反应很难实现。
为克服这两个困难，课题组采用临近使能反应技术。该技术帮助课题组找到能在温和条件下与糖的羟基高效反应的官能团。同时，邻近反应的特点又巧妙地解决了单糖的选择性。
总之，蛋白质和糖的精确交联能够在蛋白质和碳水化合物之间引入共价键，解决两种分子长期以来亲和力低、内部关系弱的问题。因此，蛋白质和糖的交联能够促进糖生物学的基础研究进步，并开发出靶向多糖诊断和治疗的创新途径。
王磊课题组在 2013 年首次提出了邻近使能反应的概念，并实现了在蛋白质中引入新的共价链接[7-8]。这些共价链接已用于提高蛋白质的各种性能，例如稳定性、活性、和光学响应等[9]。
在最新的工作中，他们把这种共价链接从蛋白质-蛋白质扩展到了蛋白质-RNA 和蛋白质-糖，证明了邻近使能反应概念对生物分子的通用性。
参考资料：
1. Wang, N., Yang, B., Fu, C., Zhu, H., Zheng, F., Kobayashi, J., Liu J., Li, S., Cheng, M., Wang, P. G., Wang, Q., Wang, L. Genetically encoding fluorosulfate-L-tyrosine to react with lysine, histidine and tyrosine via SuFEx in protein in vivo. J. Am. Chem. Soc. 140(15):4995-4999 (2018).
2. Yang, B., Tang, S., Ma, C., Li, S. T., Shao, G. C., Dang, B., DeGrado, W. F., Dong, M. Q., Wang, P. G., Ding, S., Wang, L. Spontaneous and specific chemical crosslinking in live cells to capture and identify protein interactions. Nat. Comm. 8:1-10 (2017).
3. Li, Q., Chen, Q., Klauser, P. C., Li, M., Zheng, F., Wang, N., Li, X., Zhang, Q., Fu, X., Wang, Q., Xu, Y., Wang, L.Developing Covalent Protein Drugs via Proximity-Enabled Reactive Therapeutics. Cell 182(1): 85-97 (2020).
4. Yu, B.; Li, S.; Tabata, T.; Wang, N.; Cao, L.; Kumar, G. R.; Sun, W.; Liu, J.; Ott, M. M.; and Wang, L.Accelerating PERx Reaction Enables Covalent Nanobodies for Potent Neutralization of SARS-Cov-2 and Variants. Chem 8: 2766-2783 (2022).
5. Sun, W.; Wang, N.; Liu, H.; Yu, B.; Jin, L.; Ren, X.; Shen, Y.; and Wang, L. Genetically encoded chemical crosslinking of RNA in vivo. Nat. Chem. doi: 10.1038/s41557-022-01038-4 (2022).
6.Li, S.; Wang, N.; Yu, B.; Sun, W.; and Wang, L. Genetically encoded chemical crosslinking of carbohydrate. Nat. Chem. in press, DOI: 10.1038/s41557-022-01059-z (2022)
7. Xiang Z, Ren H, Hu YS, Coin I, Wei J, Cang H, Wang L. Adding an unnatural covalent bond to proteins through proximity-enhanced bioreactivity.Nat. Methods. 2013，10(9):885-8.
8. Coin I, Katritch V, Sun T, Xiang Z, Siu FY, Beyermann M, Stevens RC, Wang L. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 2013， 5; 155(6):1258-69.
9. Cao, L.; Wang, L. New Covalent Bonding Ability for Proteins. Protein Sci. 31: 312-322 (2022).
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