今天推送的文章发表在Frontiers in Microbiology上的“Improvement of the Catalytic Ability of a Thermostable and Acidophilic β-Mannanase Using a Consensus Sequence Design Strategy”，通讯作者为中国海洋大学食品科学与工程学院的牟海津教授。
β-甘露聚糖酶是一种内切水解酶，被用作食品稳定剂、造纸漂白剂和洗涤清洁剂，还被添加到鱼类饲料(如豆粕)中，以提高营养价值。此外，利用β-甘露聚糖酶水解，可以制备出被认为是潜在新型益生元的甘露寡糖(MOS)，并将其添加到水产饲料中。因此，改善β-甘露聚糖酶的酶学性质，如热稳定性、耐酸性和高催化能力是很有必要的。
作者先前从Aspergillus kawachiiIFO 4308中获得了一种β-甘露聚糖酶(ManAK)，并在毕赤酵母中进行了异源表达。ManAK是一种耐热嗜酸性酶，其最适催化温度为80 °C，最适pH为2.0。这一特性使ManAK成为从植物胶(例如，魔芋胶、刺槐豆胶和瓜尔豆胶)中制备MOS的一种有价值的酶。然而，ManAK的低催化效率制约了MOS的经济生产。因此，在不影响其固有热稳定性和耐酸性的前提下，提高ManAK的催化效率具有重要意义。
一致序列设计(CSD)策略为设计具有高催化效率的酶提供了一种很有前途的解决方案，同时保留了酶其他原有的性质。由于催化区的氨基酸序列被普遍认为是影响酶催化效率的最重要因素之一，为了提高酶的催化效率，通常选择催化区的氨基酸作为突变靶标。然而，这种CSD策略很少被用于提高β-甘露聚糖酶的催化效率。
ManAK属于GH5家族，其催化位点上的两个关键氨基酸(Glu188和Glu296)在水解过程中起着重要的作用。ManCbs是同一家族的另一种中性甘露聚糖酶，但其催化活性远高于ManAK。ManCbs的比活可高达14 711 IU mg−1，高于ManAK。考虑到ManAK和ManCbs在催化区域有很高的序列相似性(86.4%)，根据CSD策略提高ManAK的催化效率在理论上是可行的。
在本研究中，作者采用CSD策略来合理设计潜在的酶突变体，以提高催化效率。三个重组ManAK突变体在P.pastoris中得到异源表达。对重组酶进行了纯化，并对其酶学性质进行了全面测定。通过分析ManAK与其突变体之间非共价键相互作用的变化，从结构-功能关系的角度说明了酶性质的变化。
基于CSD策略的ManAK和ManCbs序列比对分析
序列比对表明，ManAK和ManCbs Glu188附近催化区的氨基酸序列高度一致(Figure 1)。然而，ManAK中Glu296附近的氨基酸(Cys292、Cys293和Leu294)与ManCbs中的不同(Val292、Val293和His294)。结合Glu296催化区的ManAK和ManCbs的结构分析，发现第292、293、294位的3个不同氨基酸在同一β-Sheet结构中，且与Glu298相邻(Figures 1B,C)。这三个位点的氨基酸序列可能会对酶的催化效率产生重大影响。因此，构建了三个突变体(ManAKC292V、ManAKL293V和ManAKL294H)，以评估这三种氨基酸对ManAK催化效率的潜在影响。
重组甘露聚糖酶的动力学参数和催化效率
以刺槐豆胶为底物，测定了ManAK及其突变体的动力学参数。结果表明，ManAK的Vmax和Km值分别为329.3 U/mg·min和1.09 mg/ml，催化效率kcat/Km值为199.3 ml/s·mg (Table 2)。虽然三种重组甘露聚糖酶的Vmax没有明显提高，但Km值从1.09 mg/ml (ManAK)变为0.10 mg/ml (ManAKC292V)、0.14 mg/ml (ManAKL293V)和0.07 mg/ml (ManAKL294H)，说明三个突变体的底物亲和力都有所提高。
突变的氨基酸Val292、Val293和His294对ManAK的催化效率有很大影响。结果表明，3种重组甘露聚糖酶ManAKC292V、ManAKL293V和ManAKL294H的kcat/Km值分别提高了303.0%、280.4%和210.1%(Table 2)。这证明CSD策略对提高甘露聚糖酶的催化效率是有效的。还需要进一步研究以表明使用这种修饰策略是否可以类似地改善酶的其他性质。
ManAK及其突变体的其他生化特性
耐热嗜酸的β-甘露聚糖酶表现出优良的温度特性，其最适活性温度为80 °C(Figure 2A)；甚至在80 °C孵育5 min后，酶活力仍保持在19.3%左右(Figure 2D)。构建了ManAK的三个突变体，并对它们的生化特性进行了分析。在提高催化效率的同时，ManAKL293V的热稳定性也进一步提高。与ManAK相比，ManAKL293V的最适温度保持在80 ℃不变，而ManAKC292V和ManAKL294H的最适温度分别降至75 ℃和60 ℃(Figure 2A)。有趣的是，在80 °C加热5 min后，ManAKL293V保留了36.5%的初始酶活，而ManAK只保留了19.3% (Figure 2D)。
ManAK是一种极端嗜酸性的甘露聚糖酶，最适pH为2.0(Figure 3A)，在pH 2.0的缓冲溶液中处理后，保持了84.3%的相对酶活。同样，三个突变体的pH谱显示它们在酸性条件下保持了很强的活性，最适pH为酸性(Figure 3A)。然而，ManAKL294H在pH 2.0的缓冲溶液中处理后只保持了3.68%的活性，可能是因为H294是一种碱性氨基酸(Figure 3B)。
水解产物的分析
为了验证重组甘露聚糖酶的水解性能是否受到影响，对ManAK和突变体ManAKL293V的水解产物进行了比较。结果表明，酶解产物之间无显著差异(Figures 4A,C,D)，说明L293V的位点突变对水解没有负面影响。
这些酶不能切割M2，对M3的切割非常有限，这表明ManAK是一种内切甘露聚糖酶(Figure 4A)。该酶能有效地水解M4和M5，证明该酶可用于制备益生元低聚糖。此外，在M4水解过程中检测到M5糖，表明ManAK和ManAKL293V具有相似的转糖基化活性。因此，本文采用的改性策略不影响水解方式。
根据TLC分析结果，选择M4和M5为底物，对水解产物进行HPLC分析。结果与TLC分析结果一致。如Table 3所示，ManAK和ManAKL293V均能有效降解M4和M5生成小分子寡糖，M4降解过程中可检测到M5，M5降解过程中可检测到M6。此外，在降解M4和M5时，ManAK产生的主要产物为M3，组成分别为42.9%和36.4%。
为了更好地了解三种重组甘露聚糖酶催化效率的提高情况，在相同条件下测定了三种重组甘露聚糖酶释放的还原糖。结果表明，不同突变体的还原糖产量均高于ManAK，这与动力学分析结果一致(Figure 4B)。
以刺槐豆胶为底物，研究了ManAK及其突变体ManAKL293V的应用潜力。结果表明，它们能有效降解刺槐豆胶((Figures 4C,D)，水解产物为分子量在3 000 Da以下的低聚糖，表明ManAK在制备MOS方面具有应用潜力。
ManAK和突变体突变位点的结构和作用力分析
对ManAK和重组突变体的三维结构进行了模拟。结果表明，与ManAK相比，三个突变体在突变位点的结构和相互作用力都发生了变化(Figures 5–7)。模拟的ManAK三维结构表明，C292和C285之间形成了一个二硫键(Figure 5)。ManAKC292V突变破坏了二硫键。如Figure 6所示，ManAK和ManAKL293V都具有平行折叠的β-Sheet，而ManAKL293V与ManAK中原始的作用力(范德华、PI-烷基、常规氢键和共价键)相比，具有新的作用力(烷基)。ManAKL294H和ManAK在第294位的模拟结构表明，它们都参与了α-螺旋和β-折叠的二级结构(Figures 7A,B)。然而，294位相互作用力的分析结果表明，突变体ManAKL294H具有新引入的Pi-Pi堆积相互作用，并且比ManAK少了一个常规氢键(Figures 7C,D)。
为了弥补耐热嗜酸β-甘露聚糖酶ManAK催化效率低这一缺陷，本研究采用CSD方法对ManAK的催化效率进行了设计。产生了三个kcat/Km值升高的突变体(ManAKC292V、ManAKL293V和ManAKL294H)。它们的最适pH值和耐酸性变化不大，但热稳定性不同。对其稳定性和催化效率的机理进行了研究，并提供了对其结构与功能关系的直观认识，获得了一株催化效率和热稳定性都得到提高的突变体(ManAKL293V)，进一步推动了ManAK在MOS制备中的应用。
整理：孙骁
文章信息：
PMID：34539615
DOI：10.3389/fmicb.2021.722347
文章链接：https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.722347
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