细胞增殖的能力是评价细胞、代谢、生理、病理状况、细胞活性、基因毒性等的重要指标之一。

细胞增殖虽然与多种因素有关,比如细胞代谢活性、与细胞增殖相关的蛋白表达、ATP的浓度等等,但是检测细胞增殖现象的zui直接zui准确的方法就是用荧光探针直接检测遗传物质DNA的合成,这种方法是研究细胞增殖、信号通路、DNA修复及分化等等方向常用的方法。

tbl细胞激活操作图解(EdU细胞增殖检测法的操作教程来啦)(1)

目前,基于DNA的合成原理,人们最初开发了工具是BrdU染色法, 但是这种方法操作耗时长,往往需要过夜处理细胞,操作繁杂,比如需要DNA变性、抗原修复以及抗原抗体反应等操作,后来在BrdU的基础上,人们开发出了革命性的探针--EdU,这种方法不需要繁杂的操作,节约时间,且反应更灵敏和准确。并且与MTT/WST-1或者CCK-8这种依靠化学显色法只能得到一个折线图的方法相比,EdU 细胞增殖检测法可以得到高清细胞增殖现象数据图,可视化展示数据、更直观、更具视觉效果!

EdU的检测原理是什么?

EdU可以说是一款革命性的细胞增殖状态检测方法

与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比, EdU只有BrdU抗体大小的1/500,在细胞内更容易扩散,不需要严格的样品变性(酸解、热解、酶解)处理,有效地避免了样品损伤,有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况,具有更高的灵敏度和更快的检测速度。

tbl细胞激活操作图解(EdU细胞增殖检测法的操作教程来啦)(2)

EdU细胞增殖检测法的操作教程

一、首先用 EdU 来标记细胞

注意:本实验样本是 Hela 细胞,如果使用其它类型的细胞,实验可能需要做调整。建议 EdU 起始浓度是 10 µM,或者根据细胞类型设置几个梯度预实验摸索zui佳EdU浓度,再进行正式实验。

1.在六孔板里的盖玻片上培养细胞,使其生长至所需密度后处理细胞;

2.用 10 mM EdU 溶液在无血清培养基中制备 2x EdU 工作溶液;

3.预热 2x EdU 溶液,然后将 2x EdU 溶液添加到等体积含有实验细胞的培养基中,获得 1x EdU 溶液。例如,对于zui终浓度为 10 µM 的溶液,可用 20 µM EdU 的新鲜培养基替换一半含细胞的培养基

注意:建议不要更换所有的培养基,因为这会影响细胞增殖速率;

将处理好的细胞孵育12小时;

孵育完成后立即进行步骤 B

二、细胞固定和透化

1.孵育后除去培养基,并向每个含有盖玻片的孔中加入2.5 mL含多聚甲醛的 PBS,室温下孵育15分钟;

2.除去固定液,用2.5 mL PBS洗涤孔中的细胞5分钟,重复三遍;

3.除去洗涤液,然后向前五个孔中加入2.5 mL通透液, 室温下孵育20分钟;

4.除去通透缓冲液,用2.5 mL PBS洗涤每个孔中的细胞两次,除去洗涤液;

5.立即进入步骤 C。

三、 EdU 检测

每孔使用 100 µL 反应混合物。反应混合物体积可根据实际情况进行调节,但必须按比例加入反应组分。

1.制备 Click-iT 反应混合物。注意要按表中列出的顺序添加成分,否则反应将无法得到zui佳效果。配置好的 Click-iT 反应混合物必须在15分钟内使用。

2.向每个玻片上加入 100 µl Click-iT 反应混合物,室温下避光孵育 30 分钟;

3.除去反应混合物,用2.5 mL PBS洗涤每孔一次后,除去洗涤液;

可选择步骤:进行核染色(DAPI 或 Hoechst 33342)或抗体标记

提示:在孵育过程中一定要避光。如不需要其它染色,孵育后请直接进行成像和分析

Abbkine EdU细胞增殖检测试剂盒发表的文献:

1.Perilaldehyde activates AMP‐activated protein kinase to suppress the growth of gastric cancer via induction of autophagy

作者:Y Zhang, S Liu, Q Feng 杂志名称:JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY IF:3.09

2. In vitro mitochondrial-targeted antioxidant peptide induces apoptosis in cancer cells

作者:W Zhan, X Liao, L Li 杂志名称:Onco Targets Therv IF:2.31

文章来源:每日生物评论

欢迎关注每日生物评论(Bio-review)

用最专业的精神,开放性的思维,与你一起探索行业走向,快速了解这个领域!

,