【实验目的】
（1）掌握PCR产物直接克隆的T载体连接法的原理。
（2）学习并掌握采用T载体连接法进行PCR产物的直接克隆的方法及操作步骤。
【实验原理】DNA Taq聚合酶在PCR反应过程中能够在PCR产物的3’末端加上1个非模板依赖的A，而T载体是1种带有3’T突出端的载体，在连接酶的作用下，T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的A-T配对，可以把PCR产物直接插入到T载体的多克隆位点中，形成含有目的片断的重组载体，达到对PCR产物直接进行重组克隆的目的。常用的T载体有pUCm-T、pMD19T等。pUCm-T载体是在pUC19载体的基础上改造而成，是大小为2.7kb的双链DNA质粒，有1个复制起点、1个氨苄青霉素抗性基因和1个多克隆位点，适合于DNA片段的克隆、DNA测序、对外源基因进行表达等。由于核载体在lacZ领域中含有多克隆位点，因此在转化lacZ缺陷型宿主细胞（如JM109等）后，在含有IPTG、X-gal的平板上培养时，很容易通过蓝白筛选判断载体中有无DNA片段的插入。同时，还可以通过载体上的lac启动子表达外源基因、对插入载体中的DNA片段进行测序等。进行DNA测序时，可以方便地使用M13系列的通用引物。pUCm-T载体如图12.1所示。pMD19-T载体是1种高效克隆（TA克隆）PCR产物的专用载体，由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点，用EcoRⅤ进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加1个“A”的特性，所以采用T载体可以直接进行PCR的产物连接和克隆。pMD19-T载体的β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，颜色更深。因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白斑筛选。pMD19-T载体如图12.2所示。重组质粒可以通过转化大肠杆菌后，经α-互补筛选或蓝白斑筛选，对筛选出的白斑菌落可进一步用酶切电泳或PCR法进行鉴定。对于重组的质粒可以使用载体多克隆位点上的2个PstⅠ酶切位点进行PstⅠ单酶切鉴定，也可以使用廉价且高效的EcoRⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、HindⅢ等内切酶进行双酶切鉴定。构建完成的质粒可以通过质粒上的正反2个M13引物位点进行测序或通过T7promoter上的T7引物位点进行测序；可以利用T7 RNA polymerase promoter进行体外转录，用于探针标记等。
图12.1 pUCm-T载体的图谱
图12.2 pMD19-T载体的图谱
【实验材料、试剂及仪器】
1．实验材料经回收的PCR扩增DNA片段、T载体。
2．实验试剂
（1）T4连接酶。
（2）10×T4连接酶缓冲液。
（3）无菌水。
3．实验仪器
生化培养箱（全班1台）
制冰机（全班1台）
冰盒（每2人1个）
0.5mL无菌离心管（每人1支）
移液器（每2人1套）
10μL无菌吸头（若干）
台式低速离心机（每8人1台）
【实验步骤】
（1）在0.5mL离心管中加入（反应体系20μL）：PCR回收产物10μLT载体1μL10×T4连接酶缓冲液2μLT4连接酶1μL无菌水6μL
（2）3000r/min短暂离心混匀，16℃连接2～4h。
【实验注意事项】
（1）连接反应温度要适中。若温度过高，黏性末端之间形成的氢键不稳定；若温度过低，会影响连接酶的活性。
（2）使用Tip头吸取酶液过程中应准确，避免Tip头外带有过多的酶。
（3）T4DNA连接酶在冰上长时间放置不稳定，最好在使用时取出，用后立即放回－20℃冰箱。
【实验讨论】问题：PCR产物可以直接进行连接反应吗？
答：PCR产物片段需先回收纯化，因为PCR产物中含有杂质DNA片段、残存引物等杂质，都会影响TA克隆效率。
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