当中国进入列强瓜分、积贫积弱的晚清时期，很多仁人志士都想尽办法挽救时局。至少在当时人看来，百日维新是一次机会，在年轻的光绪领导下，维新运动一度开展得有声有色。然而，出于维护顽固势力利益的角度考虑，最终这次轰轰烈烈的变革还是被慈禧太后叫停，胎死腹中。
慈禧的这次举动，不仅断送了清王朝最后一次追赶世界强国的机会，更让她和光绪的关系决裂。光绪从此被幽禁在瀛台，成为不戴枷锁的囚犯。不过只要光绪还活着，维新派就还感觉到希望的存在。但令人意想不到的是，就在光绪三十四年十一月十四日、十五日一天时间内，光绪和慈禧先后去世。
慈禧去世时已经74岁了，而且已经抱病很久，并不让人意外。但光绪当时只有38岁，正值盛年，为什么会死在慈禧之前呢？因此，他的死有过猜测，认为是被毒死的。不过，《清史稿》对此只字不提，而是采用了很官方地措辞：
三十四年冬十月壬申，德宗疾大渐，太皇太后命教养宫内。癸酉，德宗崩。
就此，许多学者又纷纷支持自然病死说，并且在此基础上提出了几点理由。首先是光绪患有严重的肾病，进而产生遗精症。久病成良医，他自己都曾在日记中写明：遗精之病将二十年，前数年每月必发十数次，近数年每月不过二、三次，且有无梦不举即自遗泄之时，冬天较甚。清宫医案中也记载了光绪常患感冒及脾胃病，吃药比吃饭还频繁的情况。
其次是因为光绪长期压抑的内心，在百日维新之前，他虽然表面上与慈禧的关系和睦。但因为慈禧的严厉和权力欲，两人实质上处于面和心不和的状态。百日维新之后，光绪被幽禁起来，不仅失去自由，而且还有被废的危险，慈禧甚至已经准备了一个“大阿哥”溥儁作为替代品。在这种情况下，光绪的神经处于高度紧张的状况，自然也就容易染病，并且让病情加重。
再加上光绪缺乏像其他清朝帝王那样围猎、出游等必要的锻炼以及吸烟喝酒的嗜好，所以很多专家认为，光绪虽然年轻，但身体状况不佳，死在慈禧之前也是很有可能的。
然而，作为光绪的继任者，溥仪在1964年出版的自传《我的前半生》中，就直言不讳地指出光绪是被毒死的。他是根据一个叫做李长安的老太监说过光绪死前的情况：“在死的前一天还是好好的，只是因为用了一剂药就坏了。后来才知道这剂药是袁世凯使人送来的。”
尽管溥仪曾经是帝王，尽管他是当时就在宫中的人，但是因为当时他才三岁，也是听旁人所说，而且这个太监也没有参与谋杀计划之中。所以，很多人还是不当回事，并没有将这段话当作有力的证明。
直到2008年一份研究报告的公布，总算将光绪之死揭开了冰山一角。这是由中央电视台、中国原子能科学研究院、北京市公安局法医检验中心、清西陵文物管理处等多个权威机构的专家组成的“清光绪帝死因”专项研究课题组，运用最先进的科技手段，通过五年时间，利用光绪的头发、遗骨以及衣物等蛛丝马迹得出的结果。
这份报告认为，清光绪帝头发中的砷含量高于致死量的二百多倍，超出正常人含量的二千多倍，而周边环境未发现砷污染的痕迹，最终得出“光绪帝系砒霜中毒死亡”的结论。
可以说，这份报告以科学的态度结束了旷日持久的光绪死因争论，原来那些宫廷的医药档案都是有假，都是不可信的。但是，争议的焦点又转移到谁是凶手上来了。溥仪所说的是袁世凯；启功先生曾在回忆录中叙说自己的曾祖父亲眼看到太监奉慈禧的命令，拿毒酸奶送给光绪喝；曾担任过御前女官的德龄在《瀛台泣血记》则一口咬定是李莲英所为。
目前这三个观点都获得了一定的支持，但也存在着前后矛盾之处。事实的真相如何，可能还需要更多更新的证据。
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