从药物研制到开发、制造和QA/QC，分析型的液相色谱在药物的整个生命周期中发挥着重要作用，使得使用者能够迅速进行筛选、纯化的分析工作。现在市面上广泛使用的分析型高效液相色谱主要包括：流动相模块，在线脱气模块，动力模块（泵），进样模块，柱温箱模块，检测器模块等。以下我们将详细讨论其中流动相模块、动力模块、自动进样器模块、柱温箱模块的使用注意事项，而这些模块往往也是影响检测结果的重要模块，打算将在实验室中平时总结的注意事项加以交流。
高效液相色谱模块示意图
1、流动相模块
流动相就如同人体的血液，其质量直接影响到整个系统的正常运行与否。在日常使用中避免使用可腐蚀钢的溶剂：碱金属卤化物及其酸溶液(如：碘化锂、氯化钾等)；高浓度无机酸，如硝酸、硫酸；可能含有过氧化物的色谱纯醚(如THF、二氧六环、二丙基乙醚)，这些在使用前利用干燥氧化铝的稳定性来钝化处理过氧化物，在过氧化物外面形成一个包裹层；四氯化碳与2-异丙醇或四氢呋喃的混合液，它们不但容易形成过氧化物而且它们会腐蚀一些Peek（聚醚醚酮材料，Polyetherketone）材料的液相色谱配件。流动相可以使用超纯水、磷酸、磷酸二氢钾、三乙胺、离子对试剂、正己烷、正庚烷、甲醇、乙醇、乙腈、甲酸、甲酸胺、乙酸、乙酸胺、丙酮、异丙醇、氨水等。
流动相中的过滤器
在每瓶流动相中配有过滤器，应定期检查溶剂过滤器是否变色(尤其是盛放水相的溶剂瓶)，定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶，每三个月至少清洗一次。对于以下几点流动相部分的注意事项更是在每次使用都应当注意的。
- 应该使用HPLC级的溶剂，不能互相混溶的溶剂不可以直接切换。一般在水相和与其不能混溶的溶剂切换时，使用异丙醇作为过渡溶剂。
- 注意溶剂的截止波长。截止波长是指该溶剂可以在紫外检测器中使用的最低波长,低于该波长后,溶剂会有很强的紫外吸收，从而影响基线的稳定性、干扰对所分析物质的检测。
- HPLC所使用的水必须是新鲜的和经过0.45μm滤膜过滤过的(RRLC则必须使用0.2μm滤膜过滤)。建议每天更换新鲜的水。长期不用时，必须把使用水的管路用有机溶剂置换，防止长霉。
- 仪器使用完后要采用适当的溶剂冲洗等方法维护色谱柱和系统。如果使用了缓冲盐一定先将盐要冲洗干净。
- 仪器长期不用时，最好不要使用纯乙腈封存。因为乙腈有生成聚合物的趋势。建议使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。
2、动力（泵）模块
高效液相色谱仪一般是采用四元泵或者二元泵。四元泵在常压下将两种（或多元溶剂）输至混合器中混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。因溶剂混合在低压下进行，故称低压混合系统。二元泵用两个高压输液泵将两种溶剂输入混合器，进行混合后再进入色谱柱。因溶剂混合在高压下进行，故称高压混合系统。Waters公司的Alliance系列的采用的是四元低压混合梯度泵（带在线真空脱气机），作为其主流产品。当然Waters公司保留了二元高压混合梯度泵Brezee系列，作为普及型的产品。 岛津公司推出的LC-2010系列只有四元低压混合梯度泵一种泵型。安捷伦公司的1100系列将在线脱空气机和四元低压混合梯度泵结合，解决了气泡问题。以下是关于高效液相泵模块的常见注意事项：
四元泵的工作示意图
二元泵的工作示意图
- 将装有溶剂瓶的溶剂箱放在泵上面(或较高处)当在四元泵上使用盐溶液或有机溶剂时，建议将盐溶液接在下面的梯度阀口上，将有机溶剂接在上面的梯度阀口上。
- 用水定期冲洗除去可能在阀口析出的盐结晶。
- 操作泵之前，用至少两个体积(标准脱气机30mL，对微脱气机10mL)冲洗真
- 空脱气机，特别是当泵关闭了一段时间后(例如，过夜)，以及在通道中使用挥发性混合溶剂时。
- 当使用低流速时（不高于0.2ml/min），检查所有1/16英寸接头有无渗漏（用压力测试或漏液测试）。
- 更换活塞密封垫时检查活塞杆上是否有划痕，有划痕的活塞将导致轻度渗漏，并降低密封垫的使用寿命，所以要尽早更换有划痕的活塞。
- 使用缓冲溶液时，关泵前要先用水冲洗系统。当需要长时间使用0.1摩尔或更高浓度的缓冲液时，最好选用密封垫清洗附件以减少对密封垫及活塞杆的磨损。
- 如果使用了高浓度的缓冲盐，可以用热水（50－60℃）来冲洗盐通道来确保没有缓冲盐残留在系统中。
- 当泵头安装有柱塞清洗附件时，由于该附件中也有密封垫，这样就会增加活塞杆运动时的阻力。所以开泵前一定要用10％异丙醇，并将其流速调至约2－3滴/分钟使溶液流过冲洗装置。10％异丙醇有助于降低水的表面张力，并有抑菌作用。不要用其它溶剂代替。
- 泵头如果发出“吱吱”声不影响使用和泵的精度。
3、自动进样器模块
不同品牌和型号的高效液相色谱的自动进样器模块有一定的差别。在这里我们介绍几个经典的自动进样器模块及其使用注意事项：
安捷伦1260 Infinity液相色谱仪的自动进样器模块如下图所示，其注意事项主要是：
- 样品在进样前必须经过适当的预先处理，需要经过亚微米滤膜的过滤或者离心，防止样品中的微小颗粒堵塞管路。
- 最好使用流动相作为溶剂配制样品，所用溶剂应该对样品有较好的溶解性。所分析样品在流动相中溶解性不太好时，使用强溶剂溶剂样品容易造成峰形很差的前伸峰。
- 针座是喇叭口朝上暴露在空气中的，有时空气中的较大灰尘颗粒可能恰好落在针座的流路内而引起针座的堵塞。这时候可以尝试卸下针座，将它接在泵的出口上反冲，一般能解决问题。
- ALS一定要使用Agilent的样品瓶及瓶盖；使用不兼容的或者加工精度差的样品瓶及瓶盖会引起ALS故障率的增加及性能的降低。
- 如果有自动进样器的保温模块，注意冷凝水的管线要保持通畅，并且不要处于废液瓶液面以下。
- 自动进样器与恒温模块后的控制线，一定要在拔掉电源线后，才可以安装或者移除。
对于赛默飞WPS-3000 Auto sampler(SL)：
- 当使用专用清洗液瓶时，应在每次开机前将瓶中的溶剂换成脱气的溶剂，并注意检查量是否充足。
- 使用溶剂通道液体作为清洗液时，应在泵内置脱气机完成流动相脱气及泵排气泡后执行相应的操作，以免引入气体。
- 样品瓶、多孔板及样品托盘重新放置后，应对其放置是否正确进行确认，以免造成进样针的损坏。
- 在使用非标准样品容器或衬管时，应注意测量瓶底的高度和宽度并对进样针插入高度进行相应的修改。
对于岛津SIL-20A自动进样器，进样针不容易扎进去进样不平行，这个可以换预开口的隔垫解决。普通的SIL-20A只能耐压20MPa，在使用时注意不要超过压力限。
4、柱温箱模块
使用液相色谱进行分析时，柱温箱对实验分析的稳定性高、灵敏度、重现性作出了重要的贡献。柱温箱主要作用在于使柱子的温度保持一定，按照温度调节方式大致分为：空气循环式、水夹套式以及模块加热式。液相色谱法支配分离的的方式有：分配、吸附、离子交换、尺寸排除，这些平衡依赖于温度，通过柱温箱维持柱温，似的在试样的分离，选择性以及保留时间上得到良好的重现性。另外由于温度越高，目标成分与固定相的平衡变快，柱效将增长，分离也会有所改善。另外柱温箱有助于稳定电信号，减少信号波动，也有利于降低液体的粘度从而降低柱压。以下是关于高效液相柱温箱模块的常见注意事项：
- 连接的管路要尽量短，防止热扩散及峰增宽。
- 如果使用小体积分析柱以及流速小于0.2mL/min时建议使用左边的柱温箱(左边体积较少,3uL；右边为6uL)，也可使用低扩散组件。
- 除非特殊应用，建议将两边温度设置一样。
- 在使用冷却功能时，要防止因冷凝水而触发漏液传感器。
- 一般分析柱接到左边3μL内体积的加热块上，半制备柱可以接在右边6μL内体积的加热块上。如果必要，如做GPC（Gel Permeation Chromatography，凝胶渗透色谱分析）等对稳定要求高的分析时，可以将两个加热块串接，得到更好的温度稳定性。
- 在实验过程中要关好前盖。
- 换柱的时候，注意螺丝一定要注意，先用手旋紧后，再用扳手旋紧。
参考文献
1.YinH, Killeen K. The fundamental aspects and applications of Agilent HPLC‐Chip[J].Journal of separation science, 2007, 30(10): 1427-1434.
2. McMasterM C, HPLC A. A Practical User’s Guide [M]. VCH, New York, 1994.
3.SnyderL R, Kirkland J J, Glajch J L. Practical HPLC method development[M]. John Wiley& Sons, 2012.
4. 岛津SIL-20A/AC用户手册
5. 安捷伦1260G1329-97015用户手册
6. 赛默飞WPS-3000用户手册
7. 日立Primaide1210自动进样器说明
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