本文引用：吴云虹, 周少珑, 王景, 蔡奕秋, 林雅明. 结核性脑膜炎患者血清神经细胞黏附分子1与转甲状腺素蛋白的表达及临床意义研究. 中国全科医学[J], 2022, 25(12): 1435-1440 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2021.02.110
WUYunhong, ZHOUShaolong, WANGJing, CAIYiqiu, LINYaming. Expression Levels and Clinical Significance of Serum NCAM1 and TTR in Tuberculous Meningitis. Chinese General Practice[J], 2022, 25(12): 1435-1440 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2021.02.110
结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是肺外结核疾病中严重的类型之一，由结核分枝杆菌感染中枢神经系统引起，可导致脑膜、脉络丛和室管膜炎性反应、脑积水、颅内压增高甚至脑疝，临床病死率高，存活者易遗留神经系统后遗症[1]。TBM起病隐匿，病程长，症状轻重不一，临床诊断和治疗困难，早期发现和诊断是改善TBM预后的关键[2]。神经细胞黏附分子1（neural cell adhesion molecule 1，NCAM1）是免疫球蛋白分子超家族中的细胞黏附家族分子，主要在神经系统中表达，参与调节神经细胞的功能和神经元迁移以及神经损伤后的突触重组，与神经系统疾病存在密切关系[3]。转甲状腺素蛋白（transthyretin，TTR）是一种甲状腺激素结合蛋白，可将甲状腺素从血液输送到大脑，TTR功能异常可导致心肌病、自主神经疾病以及神经系统疾病[4]。而NCAM1、TTR与TBM是否存在关联尚不完全清楚。本研究拟探讨NCAM1、TTR与TBM的关系，旨在为临床诊治提供参考。
1 资料与方法1.1 临床资料选择2017年3月至2020年12月三亚市人民医院和三亚市中心医院收治的114例TBM患者为TBM组，其中男67例、女47例，年龄27~46岁，平均年龄（35.3±7.0）岁。选择同期于三亚市人民医院和三亚市中心医院体检中心体检的46例健康志愿者为对照组，其中男29例、女17例，年龄26~48岁，平均年龄（35.3±7.1）岁。两组均排除神经系统疾病、颅内感染、颅内肿瘤等疾病。TBM组和对照组的性别构成、平均年龄比较，差异无统计学意义（χ2=0.249，t=0.033，P>0.05）。
1.2 TBM患者纳入与排除标准纳入标准：（1）符合《内科学》[5]中的脑膜炎诊断标准；（2）脑脊液常规培养分离出结核分枝杆菌[6]；（3）年龄18周岁以上。排除标准：（1）细菌、病毒性脑膜炎；（2）癫痫、脑梗死、脑出血；（3）阿尔茨海默病、帕金森、血管性痴呆等；（4）脑膜癌病；（5）随访失联。
1.3 TBM患者分期根据英国医学研究理事会（MRC）分期标准[7]，将患者分为Ⅰ期（无局灶神经系统损伤体征）31例、Ⅱ期（脑膜刺激征、轻度感觉和运动功能异常）45例、Ⅲ期（惊厥或抽搐、昏睡或昏迷）38例。
本研究经三亚市人民医院伦理委员会批准（批准号：201711053）。TBM组患者或其家属及对照组均对本研究知情同意并签署同意书。
1.4 实验室检查TBM组在入组当日（基线）、入院7 d、入院14 d、随访1个月、随访6个月、随访1年时分别采集静脉血、脑脊液。对照组在体检当日（基线）仅采集静脉血。干燥试管（3 ml）血标本室温下静置30 min后取上清液离心（离心半径13.5 cm，转速2 000 r/min）10 min，收集血清于-80 ℃冷冻保存备检，抗凝试管标本混匀后直接上机检测。脑脊液收集于专用标本瓶待检。取血清样本复溶，采用Multiskan FC酶标仪（美国赛默飞公司）、酶联免疫吸附试验检测血清NCAM1、TTR水平，试剂盒购自美国赛默飞公司。DxH 800全自动血细胞分析仪（美国贝克曼库尔特公司）检测外周血白细胞计数、脑脊液有核细胞数、有核细胞/单核细胞比值。采用DxC 800全自动生化仪系统（美国贝克曼库尔特公司）检测血清白蛋白、血钠、血钾水平。
1.5 观察指标收集TBM组年龄、性别、合并疾病（糖尿病、艾滋病、肺结核）、既往病史（结核患者接触史、结核病史）、入院症状（体质量减轻、意识改变、癫痫、认知功能障碍）、入院生命体征（心率、呼吸、收缩压和舒张压）、入院体格检查（颅神经麻痹、脑膜刺激征、外周神经功能异常）、影像学检查（脑积水、脑梗死病灶、结核瘤）、MRC分期、住院时间、发病至抗结核治疗时间、和实验室检查指标。
TBM组患者均接受抗结核治疗，治疗结束后随访1年，根据改良Rankin量表（Modified Rankin Scale，mRS）[8]评估神经预后：0分，完全无遗留症状；1分，有遗留症状，但无功能障碍；2分，遗留轻度残疾；3分，中度残疾；4分，中重度残疾；5分，重度残疾；6分，死亡。0~2分为预后良好（63例），≥3分为预后不良（51例）。
1.6 统计学方法采用SPSS 25.0软件进行数据分析，经Shapiro-Wilk检验符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，三组间比较采用单因素方差分析，重复测量数据比较采用重复测量方差分析。偏态计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。计数资料以相对数表示，采用χ2检验。采用多因素Logistic回归分析探讨TBM预后的影响因素，绘制NCAM1、TTR预测TBM患者预后的受试者工作特征（ROC）曲线，采用DeLong检验比较ROC曲线下面积。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果2.1 对照组和TBM组基线血清NCAM1、TTR水平比较TBM组基线血清NCAM1、TTR水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
Table 1 Comparison of baseline serum NCAM1 and TTR levels between healthy physical examinees and tuberculous meningitis patients
2.2 不同病情程度TBM患者基线血清NCAM1、TTR水平比较Ⅲ期TBM患者血清NCAM1、TTR水平低于Ⅱ期和Ⅰ期TBM患者，差异有统计学意义（P<0.05）；Ⅱ期TBM患者血清NCAM1、TTR水平低于Ⅰ期TBM患者，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
Table 2 Comparison of baseline serum NCAM1 and TTR levels in tuberculous meningitis patients by the stage distinguished by British Medical Research Council staging system
2.3 不同预后TBM患者血清NCAM1、TTR水平变化组间与时间对不同预后TBM患者血清NCAM1、TTR水平存在交互作用（P<0.05），组间及时间分别对血清NCAM1、TTR水平主效应显著（P<0.05），其中预后不良TBM患者基线、入院7 d、入院14 d、随访1个月、随访6个月、随访12个月血清NCAM1、TTR水平均低于预后良好TBM患者（P<0.05），见表3。
Table 3 Differences of serum NCAM1 and TTR levels in tuberculous meningitis patients with good and poor prognosis
2.4 影响TBM患者预后的因素分析预后不良TBM患者的年龄、意识改变、认知功能障碍、颅神经麻痹、脑积水比例、住院时间、脑脊液有核细胞数、脑脊液有核细胞/单核细胞比值高于预后良好TBM患者，差异有统计学意义（P<0.05）；两组MRC分级比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。将上述有统计学差异的指标纳入多因素Logistic回归分析，以ENTER法筛选变量，结果显示MRC分期为Ⅲ期是TBM患者预后不良的危险因素（P<0.05），基线高水平NCAM1、TTR是TBM患者预后不良的保护因素（P<0.05），见表5。
Table 4 Univariate analysis of associated factors for prognosis in tuberculous meningitis patients
Table 5 Multivariate Logistic regression analysis of prognostic factors in tuberculous meningitis patients
2.5 基线NCAM1、TTR预测TBM患者预后的价值分析基线NCAM1、TTR预测TBM患者预后不良的截断值为210.15 mg/L、125.36 mg/L，ROC曲线下面积为0.665、0.689，联合（基线NCAM1 基线TTR）（结合多因素Logistic回归分析计算联合预测值）预测TBM患者预后的ROC曲线下面积为0.879，高于单独基线NCAM1、TTR的ROC曲线下面积（Z=4.428、3.941，P<0.001），见图1和表6。
Figure 1
Figure 1 ROC curve of baseline NCAM1 and TTR，either alone or in combination，in predicting prognosis of tuberculous meningitis patients
Table 6 Efficacy of baseline NCAM1 and TTR，either alone or in combination，in predicting prognosis of tuberculous meningitis patients
3 讨论TBM是一种高死亡率和高致残率的神经系统感染性疾病，尽管接受了足够疗程的抗结核治疗，但成年TBM患者预后依然很差[9]。结核分枝杆菌通过淋巴系统或血液运输至全身，并跨越血-脑脊液屏障进入中枢神经系统，直接感染小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元，导致白介素6、肿瘤坏死因子α等多种致炎细胞因子分泌和活性氧生成，介导炎性反应，进一步增加血-脑脊液屏障通透性，引起脑脊液白细胞增多、蛋白质积累和脑膜炎症，且细菌负荷持续存在与脑膜炎病理程度加重密切相关[10]。目前TBM的诊断主要结合临床症状、脑脊液实验室检查和颅脑影像学检查等，脑脊液病原学诊断是TBM实验诊断的金标准，但培养时间长（42 d）、培养成本高，容易导致病情延误，TBM的治疗目前仍是基于肺结核治疗方案，由于血-脑脊液屏障渗透性差，可能导致脑脊液中的药物浓度不理想，治疗效果不佳[11]。因此迫切需要探讨与TBM密切相关的生物标志物。
NCAM1是一种多功能跨膜蛋白，位于人类11号染色体（11q23.1），主要在神经元和神经胶质细胞中表达，介导神经细胞的识别和黏附，参与突触可塑性、中枢神经发育和神经发生，NCAM1功能障碍会损害突触形成、突触活动和可塑性[12，13]。现有研究发现NCAM1异常表达与双相情感障碍、精神分裂症有关[12]，自闭症谱系障碍患儿血浆NCAM1水平明显降低，且NCAM1水平与社会动机、社会交流和社会反应呈负相关[13]。NCAM1还可通过与S100A9淀粉样蛋白相互作用，以浓度依赖性方式促进S100A9淀粉样蛋白触发的级联反应和神经炎性反应，参与神经退行性疾病[14]，与空间记忆受损和认知功能障碍有关[15]。NCAM1与TBM的报道十分少见，本研究发现TBM患者基线血清NCAM1水平明显降低，且随着TBM病情加重而降低，预后不良患者血清NCAM1水平在基线、入院7 d、入院14 d、随访1个月、随访6个月、随访12个月时均低于预后良好患者，多因素Logistic回归分析结果显示NCAM1与TBM预后不良有关，表明NCAM1缺失可能与TBM发病和病情进展有关，分析原因可能为：结核分枝杆菌颅内感染引起神经细胞损伤，导致NCAM1合成减少，NCAM1缺失可进一步影响受损神经组织修复和新生神经发生，加重病情进展。ROC曲线分析结果显示NCAM1预测TBM患者预后不良的ROC曲线下面积为0.665，可以看出NCAM1预测TBM患者预后不良具有较高的效能，提示NCAM1有望作为TBM预后预测的潜在标志物。
TTR是甲状腺素和视黄醇的载体蛋白，位于人类18号染色体（18q11.2-12.1），由肝脏或脉络丛产生后易位到血液或脑脊液中，以四聚体形式存在，负责运输甲状腺素和视黄醇[16]。TTR作为载体蛋白通过与淀粉样蛋白β（Amyloid beta，Aβ）寡聚体结合抑制新Aβ聚集体的生长和形成，降低细胞毒性。TTR结构突变会降低蛋白质的稳定性，导致四聚体的不稳定性和分解，形成淀粉样TTR聚集体，沉积到组织和神经元中并诱导细胞毒性作用，引起不同淀粉样变疾病，由此TTR被认为是淀粉样变性的生物学标志物[17]。本研究发现TBM患者基线血清TTR水平降低，且预后不良患者不论在基线还是入院7 d、入院14 d、随访1个月、随访6个月、随访12个月时血清TTR水平均低于预后良好患者，说明低水平TTR与TBM神经系统损害加重和预后不良有关。脑膜炎大鼠模型可观察到大脑皮质Aβ1~42表达增高和神经胶质细胞活化，这与神经认知功能衰退和脑膜炎后遗留神经系统后遗症有关[18]，而TTR可切割Aβ形成活性较低的短肽，降解已经聚集的Aβ肽，TTR正常表达下，Aβ聚集减少并且Aβ的毒性被消除[19，20]，说明TTR可通过抑制Aβ活性和沉积，预防脑膜炎引起的淀粉样变性，减轻神经组织损伤，而TTR减少后其对Aβ活性抑制作用降低，导致脑膜炎后神经元损伤和神经预后不良。本研究结果显示TTR预测TBM患者预后不良的ROC曲线下面积为0.689，说明TTR具有预测TBM患者预后的效能，但是灵敏度和特异度均偏低，两者联合后预测效能明显提高，可为TBM预后判断提供更可靠的信息。
本研究多因素Logistic回归分析结果显示MRC分期Ⅲ期是TBM患者预后不良的危险因素，说明TBM神经损伤越重，患者遗留神经系统后遗症的可能性越大，临床对于Ⅲ期患者应提高警惕，优化治疗方案，以避免神经预后不良的发生。
综上，TBM患者血清NCAM1、TTR水平均降低，NCAM1、TTR水平低下与TBM发生和病情加重有关。NCAM1、TTR缺乏可能通过加重神经系统损伤参与TBM发病和进展过程，联合两项指标诊断TBM具有更高的效能。
本研究不足之处在于样本例数偏少，可能导致统计学偏倚，该结论尚待进一步扩大样本例数加以探讨；尚未纳入其他脑膜炎病例，NCAM1、TTR是否可鉴别TBM和其他类型脑膜炎尚不完全清楚，仍需进一步招募其他类型脑膜炎病例加以证实。
本文无利益冲突。
本文表格略
参考文献略
结核性脑膜炎患者血清神经细胞黏附分子1与转甲状腺素蛋白的表达及临床意义研究
,
