相信各位经常进行分子克隆实验的小伙伴对载体构建实验非常熟悉，通过这项实验，我们能够将自己期望的DNA片段组装到目的质粒，随后经过感受态细胞转化等操作得到重组质粒。实现载体构建的技术方法有多种，如酶切连接法、Gateway克隆、同源重组克隆等，其中Vazyme同源重组方法以其简单、快速且高效的特点，帮助了众多小伙伴顺利完成了载体构建实验。但实验的道路不总是一帆风顺，也会碰到许多问题，其中最常见的是涂板不长克隆。
今天小V带着大家一起探讨这类问题的分析和优化策略，帮助大家在遇到时，能够更好更快的找到原因并合理改进实验。
首先，分析引物设计、线性化载体及目的片段
01引物设计
✦建议同源臂长度15-20bp（酶切位点序列不包含在内），GC含量40-60%，超出范围会影响重组效率
以下图为例解析单片端同源重组引物的设计原则：
载体pUC19，使用限制性内切酶EcoR I、Hind III双酶切方式线性化
灰色框内序列组成：同源重组的同源臂 酶切位点
同源重组引物设计原则（如下图所示）
✦推荐使用CE Design引物设计软件，选择对应模块，按要求输入序列完成引物设计
软件可从下述几种途径获取：
1.登录Vazyme公司官网（http://www.vazyme.com），选择生命科学→资源支持→常用工具→实验工具→CE Design引物设计软件
2.复制链接
https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html
02线性化载体和插入片段
线性化载体和插入片段的长度范围及制备方式
✦插入片段和线性化载体，推荐使用切胶回收方式进行纯化回收（切胶时间最好控制在3min内）。
✦使用Nanodrop/Onedrop等仪器检测核酸浓度。若浓度小于20ng/μl，建议多做几管，合并在同一管回收，提高浓度
注：通过凝胶电泳将片段条带与DNA Marker条带的亮度比对估算条带浓度，若实验室的核酸染料为EB染料，可以判断；若为EB替代物，尤其Gelred等大分子核酸染料，不建议使用该方法。Gelred等大分子染料的浓度线性范围和EB不同，对核酸浓度的分辨率不高，不同浓度的核酸条带亮度差不多。
其次，分析重组反应体系和操作
01重组反应体系
✦线性化载体和插入片段的使用量
线性化载体和插入片段的最适使用量计算及使用量范围
注：线性化载体和插入片段的区分依靠长度判断，长度最长的片段为线性化载体，其余为插入片段；若计算得到的最适使用量超出对应使用量范围，则使用对应范围的极限值。
✦重组体系各组分的投入体积最好≥1μl
若投入体积<1μl，可能因小体积取样不准确影响投入量的准确性（回收产物浓度高时可稀释使用）。
✦重组体系建议按说明书配制
C112、C113体系总体积为20μl，C115体系总体积为10μl。
✦进行阳性对照反应，排除其他实验材料及操作因素的影响
使用试剂盒中提供的线性化载体和插入片段，按说明书配制重组反应体系。
02重组反应程序与环境
✦反应程序
37℃，30min（C112、C113），同源臂GC含量偏高时可改为50℃，15min；50℃，5min（C115单片端重组），DNA总量300-400ng时改为50℃，15min；
50℃，15min（C115多片段重组），4-5个片段重组时改为50℃，30min。
注意事项
✦反应建议使用PCR仪进行。水浴锅等常规仪器对温度控制不精确（尤其37℃），影响重组效率。
最后，分析感受态细胞转化与涂板操作
01感受态细胞转化
✦感受态细胞的选择：选用克隆用化学感受态细胞，不可选择电击感受态
DH5α、FastT1适合≤15kb质粒转化；XL10适合>10kb质粒转化。
✦重组产物与感受态细胞用量
重组产物体积：感受态细胞体积=1：10，推荐10μl重组产物 100μl感受态细胞。
02涂板操作
✦抗生素抗性：平板使用抗性与转化的载体抗性需保持一致。
✦菌液涂板体积：建议将菌液离心，移液枪吸取丢弃多余LB培养基，保留100μl重悬，全部涂板。
如果屏幕前的你对于同源重组实验还有问题，不妨动动手指在下方评论区留言，小V期待与你相遇。
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