本文由伯小远翻译自Bio-protocol。Bio-protocol是为一线科研人员服务的期刊，其专精于遴选、发表从基础到高级，从传统到创新的各种实验方案。
摘要
烟草（N. benthamiana）是一个用于高水平、瞬时表达蛋白的良好系统。本protocol详细描述了如何在烟草叶片中瞬时表达蛋白和完成免疫共沉淀（Co-IP）实验，适用于蛋白纯化、研究蛋白-蛋白相互作用以及其他蛋白相关实验。
材料和试剂
1.烟草种子
2.已转入双元载体（如pCAMBIA1300、pBIN19等，靶基因带有蛋白标签，本文以3×FLAG标签作为例子）的农杆菌菌株
3.乙酰丁香酮（Sigma-Aldrich，目录号： D134406）
4.MES（pH5.6）（Sigma-Aldrich，目录号： M8250）
5.蛋白酶抑制剂（Roche，目录号：04693132001）
6.NP-40（Fluka，目录号：74385）
7.诱导培养基（见配方）
8.侵染培养液（见配方）
9.提取缓冲液（见配方）
10.TBS（见配方）
11.4×SDS（见配方）
设备
1.Anti-FLAG珠（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）
2.3×FLAG多肽（Sigma-Aldrich，目录号：F3290）
3.蛋白G琼脂糖珠（GE，目录号：17-0618-01）
4.用于农杆菌培养的试管、摇床等
5.离心机
6.1mL注射器
步骤
1.选取生长于22℃（16h光照/8h黑暗）四周龄左右的烟草。将已转入双元载体（目的基因与3×FLAG标签相连）的农杆菌菌株，在3mL含有相应抗生素的LB液体培养基中28℃、200rpm过夜培养。
2.准备诱导培养基，将LB培养基中的农杆菌接种到诱导培养基中（过夜培养物按1/100稀释，或者培养8h的培养物按1/25稀释）。可在早上准备好后当晚进行侵染，或在晚上准备好后第二天早上做侵染。
3.28℃、200rpm培养8-12h使农杆菌细胞处于对数生长期，OD=0.6-0.8。
4.将农杆菌培养物在50mL离心管中以3200×g的速度离心10min。
5.准备好侵染培养液。
6.在5-10mL的侵染培养液中重悬农杆菌沉淀。
7.使农杆菌重悬液的OD=0.1-0.3，每片叶子准备1mL重悬液即可。如果你想表达两种及以上蛋白，将每种农杆菌调好OD后混合即可。对于不同的质粒，推荐先进行预实验，通过调节OD值来控制蛋白的表达量，例如用更高OD的农杆菌来表达低丰度蛋白，用更低OD的农杆菌来表达高丰度的蛋白。
8.注射前30min，对烟草植株浇水，这样可以更容易进行注射。
9.选择合适的叶片进行注射。选择外观健康的叶片，不要使用破损的叶片。理想的叶片是嫩叶，3-5cm宽，每株使用2-3片叶片。每个叶片大约0.1g，足够检测蛋白含量了。对于Co-IP实验来说，10片叶片足够了。
10.涡旋农杆菌菌液使其悬浮，利用去掉针头的1mL注射器将农杆菌菌液注射至叶片的背面，注射时动作尽量轻柔，勿损伤叶片。侵染区域可以很容易辨别出来，因为其会被水浸透。如果用力推进注射器但侵染区域停止扩大，那就换个区域继续注射，只要能覆盖整个叶片即可。对侵染区域的数量并没有特殊要求，但一般每片叶子少于5个。侵染结束后，将植株放置于原生长环境下进行培养。
11.培养36-48h后，摘取被侵染的烟草叶片。1g鲜样一般足够。如果需要检测哪个时间点表达的蛋白含量最高，则需要进行实验确定。
12.放入研钵，用液氮研磨样品。
13.向研钵中加入提取缓冲液（见配方，2% PVPP 10mM DTT 1×PI 1mM PMSF），每克组织加约2mL提取缓冲液，放入4℃冰箱，等到粉末开始融化，并通过研磨使混合物均质。
14.将13步中的混合物转移至1.5mL Ep管中，以最高速、4℃离心10min。
15.将上清液转移至新的Ep管中，并再次离心。
16.将上清液转移至新的Ep管中，加入20% NP40至终浓度为0.15%。
17.将20μL蛋白G琼脂糖珠加入样品中，在冷室中孵育30min（珠子使用1mL提取缓冲液进行预平衡，并在12,000×g离心30s后弃上清）。
18.通过12,000×g离心30s将珠子沉淀，并将上清液转移到新管中。取60μL上清作为Input样品，作为对照，表示免疫沉淀前的样品。
19.在上清液中加入10μL anti-FLAG珠。珠子也需要平衡，同步骤17，4°C孵育3h。
20.离心沉淀珠子，取60μL上清液作为实验样品。
21.用1mL提取缓冲液（含0.15% NP40）清洗珠子3次。清洗步骤是：加入1mL提取缓冲液，4°C、12,000×g离心1min来沉淀珠子，丢弃上清液。
22.再加入100μL稀释的3×FLAG多肽，冷室孵育1h（在含有1mM EDTA和1×蛋白酶抑制剂的TBS中稀释3×FLAG储存液至1/10的浓度。溶解于TBS的2.5mg/mL 3×FLAG储存液可在-20°C下储存多年）。
23.离心以沉淀珠子，将上清液转移至干净的Ep管中。向上清液中加入35μL 4×SDS上样缓冲液。该部分是含有纯化后的免疫沉淀蛋白的洗脱样品。将60μL 1×SDS上样缓冲液加入含有珠子的Ep管中。珠子可能含有无法洗脱的残留蛋白质。
24.在Input组和实验组样品中加入适当体积的4×SDS加载缓冲液。将所有样品在95-100°C下煮沸5-10min。并使用蛋白质印迹分析样品。
数据
以下为一个典型的Co-IP实验结果图。
图1 Co-IP检测bHLH84-HA与SNC1-FLAG的相互作用 (Xu et al., 2014)。
注：
1.在Co-IP实验中必须有阴性对照。对于单个的蛋白质免疫沉淀，以表达空载体作为阴性对照。对于两种或多种蛋白的免疫共沉淀，建议将不含诱饵蛋白的空载与含有猎物蛋白的相关载体一起表达。根据不同的实验设计，可以包括更多的阴性对照。
2.尽管IP的效率在不同的实验中可能略有不同，只要蛋白被拉下，免疫沉淀实验就具有高度的可重复性。
配方
1.诱导培养基
2.侵染培养液
3.提取缓冲液
10%甘油
25mM Tris-HCl1mM EDTA
150mM NaCl
4.TBS
10mM Tris-HCl
150mM NaCl（pH7.4）
5.4×SDS
200mM Tris-HCl（pH6.8）
8% SDS
40%甘油
0.04%溴酚蓝
400mM DTT
伯远生物可提供以下技术服务
Co-IP（用于验证蛋白-蛋白相互作用）
IP-MS（用于寻找已知蛋白和未知蛋白的相互作用）
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References：
Moffett, P., Farnham, G., Peart, J. and Baulcombe, D. C. (2002). Interaction between domains of a plant NBS-LRR protein in disease resistance-related cell death. EMBO J 21(17): 4511-4519.
Van den Ackerveken, G., Marois, E. and Bonas, U. (1996). Recognition of the bacterial avirulence protein AvrBs3 occurs inside the host plant cell. Cell 87(7): 1307-1316.
Xu, F., Kapos, P., Cheng, Y. T., Li, M., Zhang, Y. and Li, X. (2014). NLR-associating transcription factor bHLH84 and its paralogs function redundantly in plant immunity. PLoS Pathog 10(8): e1004312.
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