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呼吸道病原体靶向检测96项
呼吸道腺病毒检测技术研究现状
呼吸道腺病毒检测技术研究现状
李享大，李青凤
1.第三军医大学，重庆404100；2．北京军区疾病预防控制中心
【摘要】：对目前实验室、临床常用的呼吸道腺病毒检测方法加以综述，从而了解目前腺病毒最有效、快捷的检测方法，为及时发现腺病毒感染疫情并掌握其流行趋势，迅速采取有效防控措施提供前提保障，为一线检测工作者提供参考。
【关键词】：呼吸道腺病毒；病原检测；方法对比
【中图分类号】：R511.8
【文献标识码】：A
【文章编号】：1003 - 6245( 2016)010 -1119 - 04
【作者简介】李享大（1992 -），男，本科在读，研究方向：痫原体检测及分析
【通讯作者】邓志爱，E-mail: 2413513350@qq.com
人腺病毒（human adenovirus，HAdV）属于腺病毒科、哺乳动物腺病毒属，是一种感染人体的常见病原体，可以通过呼吸道、肠道、眼睛、膀胱以及肝脏进行传播，并造成流行性腺病毒相关疾病的传播。因其主要引起呼吸道感染和消化道症状，故可分为呼吸道腺病毒和肠道腺病毒。迄今为止，文献报道的人类腺病毒已有60多个型别，分为A~F型6个亚属．其中按传统血清型别鉴定方法已确定51个血清型，而52~ 67型腺病毒划分则基于全基因组测序和生物信息学分析。新型腺病毒主要由组内基因重组而来，其发病机制和危害尚待研究。因此，了解目前最有效、快捷的腺病毒检测方法对加强呼吸道腺病毒感染的监测及研究尤为重要，可为及时发现疫情并掌握病毒流行趋势，迅速采取有效防控措施提供前提保障。同时有助于发现腺病毒的新亚型，为进一步研究腺病毒奠定基础。
本文对目前呼吸道腺病毒检测的常用方法进行归纳对比，旨在为现阶段的呼吸道腺病毒检测工作提供依据。
1 病毒培养法
1.1 传统细胞培养
细胞病毒培养技术与其他技术相比更为开放，检测范围相对广泛，包括未被怀疑甚至被发现过的新病毒。但它对标本储存和运送要求严格，需保证病毒的活性，通常检测时间较长，一般3-21 d；病毒培养作为公认的病原诊断“金标准”，无论分离新发病毒还是对抗病毒药物敏感性检测，尤其原有病毒有较大变异时，其地位是其他检测方法无法代替的。
1.2 离心细胞培养法 ( shellvialculture，SVC) SVC
是一种经过改良的细胞培养技术，该方法是将细胞培养在小试管底部的盖玻片上，临床标本接种于管内后，通过慢速离心使标本中的病毒颗粒在外力作用下被挤压吸附于细胞表面，从而大大缩短培养时间，提高敏感性。观测结果一般结合免疫荧光，无需观察细胞病变效应。据Shih SR等报道，SCV结合免疫荧光法可将呼吸道病毒检测的时间缩短至24 h。许多专家表示该方法较常规病毒培养法更敏感。
1.3 混合快速细胞培养法
该方法打破了一份标本需同时接种多种细胞进行检测的瓶颈。Barenfanger J等将水貂细胞MvlLu和人肺腺癌细胞A549混合组成R - mix细胞离心培养，结合间接免疫荧光法检测临床常见7种呼吸道病毒，检测周期缩短至1.4 d。混合快速细胞培养的时效性显著提高，敏感性相当或略高于传统方法。随着低温保存的即用型R-mix细胞(cryopreservedR - mixReadycell)的逐步应用，该技术有望为基础研究及临床诊断提供更有价值的参考依据。
2 分子生物学检测法
PCR方法检测腺病毒，首先需通过鼻咽拭子法采集急性呼吸道疾病感染者的鼻咽分泌物，并提敢病毒核酸进行扩增检测。以下是目前常用的几种PCR技术及其优缺点的比较。
2.1 传统PCR技术首先提取标本DNA
按（以广州华银基因科技有限公司试剂盒为例）试剂盒说明操作，分别以腺病毒通用引物和不同型别腺病毒的特异引物为分型引物进行PCR扩增。反应体系均为25 ul( 10mmol/L TrisHCl, pH8.6,50 mmol/L KCI,1.5mmol/LMgcl2，特异引物各15 pmo/L）；条件为94℃2 min．94℃30 s．55℃30 s．72℃60 s，35个循环，最后72℃延伸5 min。扩增产物经20-/0琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯观察是否相应大小的条带即可。
另外，还可以对PCR扩增产物进行腺病毒hexon基因测序，将PCR纯化产物与Pmd18 - Tsimple载体进行连接并转化大肠埃希菌DH5 -仅，在青霉素平板上筛选转化菌，对重组子进行基因测序，测序结果在GenBank中进行Blast比对分析，从而确定扩增产物中是否有腺病毒的目的基因。
总的来说，PCR是一种检测腺病毒DNA的特异性方法，其灵敏性明显高于病毒分离。方法相对简便，多数实验室均可应用，便于推广，尤其对及时有效地预防和控制呼吸道腺病毒的暴发流行具有重大意义。其局限性在于：常规PCR模板制备过程往往比较繁琐，且易导致模板丢失，限制其在常规临床诊断中的应用。腺病毒hexon基因测序在PCR的基础上更进一步地从分子水平确定是否为腺病毒感染，具有更高的特异度和准确性。但其耗时较长、操作较为繁琐，在对检测结果准确性要求较高的时候可以考虑使用。
2.2 实时定量荧光PCR常规方法提取病毒核酸，进行荧光定量PCR（以日本TaKaRa公司试剂盒为例）。反应条件：第1阶段逆转录42℃5 min．95℃10 s；第2阶段PCR反应95℃5s，60℃30 s，40个循环。检洌结果直接在显示屏观察，待检样本Ct≤35为阳性，Ct >35为阴性。
实时荧光定量PCR是目前应用较多的PCR检测方法，具有灵敏度高、操作方便、省时省力的特点，其检测结果可以通过绘制标准曲线直接反应初始模板中目的基因的含量，不需要进行扩增产物的检测，自动化程度高，降低了扩增产物污染的风险，因而受到广大科研、临床工作者的青睐。定量时分为绝对定量和相对定量：绝对定量可测定样品中目的基因的准确拷贝数，但需要知道拷贝数的绝对标准品，做出相应标准曲线；相对定量需在体系中引入管家基因进行比较，通常应用于基因差异性表达分析。特异性荧光标记主要包括Taqman探针、相邻探针法、分子信标等。Taqman探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团，结构简单易设计，已在病原检测方面得到广泛应用。
2.3 核苷酸序列依赖扩增法 ( nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)
NASBA为一种持续等温序列扩增技术。需反转录酶、RNA酶H和DNA依赖的RNA聚合酶，引物两端分别含有目标特异性序列和RNA聚合酶启动子，通过合成cDNA中间体模仿病毒逆转录过程。该技术不需单独逆转汞反应，受DNA污染几率小。但因酶不耐热，反应温度较低，因此特异性相对降低。Loens K等通过对比试验发现：NASBA敏感性与RT - PCR -致，且明显高于传统病毒培养。
2.4 多重PCR 多重PCR是通过在反应体系中添加多对引物进行复杂的核酸扩增技术，能够同时检测多种病原体。由于反应过程中会增加错配可能性，使反应敏感性、特异性不及单一反应，但因其可以大大节省人力物力、缩短检测时间，更适用于多病原监测。
2.5 套式PCRMitchell S等针对腺病毒的六邻体hexon基因最新优化了病毒检测的套式PCR条件，首先用外层引物(2A、2B)进行hexon基因的一段300 bp序列的扩增。10¨1反应体系中各成分终浓度为：0.2 mmol/L dNTP，3.5 mmol/L Mgcl2，10mmol/L Tris - HCl( pH9. 0),50 mmol/L KCl,0.1%TritonX - 100，0.2 mmol/L引物2A、2B和0.25 UTaqDNA聚合酶和2¨l病毒DNA提取液。PCR反应为：94℃，3 min，35个扩增循环(94℃10 s；43℃10 s；72℃30 s)，72℃延伸5 min；内层引物(2C3、2D2)扩增体系与条件同上。反应完毕，将产物经2%琼脂凝胶电泳观察。
外层引物对：
2A:5’ - GCCCCACTCCTCTTACATGCACATC -3'
2B:5’ - CAGCACGCCGCGGATGTCAAAGT -3’
内层引物对：
2C3:5’ - GACGCCTCCGACTACCTSWSYCC -3'
2D2:5’ - TACGAGTACGTGGTGTCCTCKCGRTC -3’
套式PCR具有较高的灵敏度，Mitchell等优化了病毒检测的套式PCR条件，使其对腺病毒检测的特异性更强。内层引物对设计扩增hexon基因中一小段核心序列（从18 892位点-19076位点间的185 bp）。这种检测方法临床诊断灵敏率达1000-/0（以直接分离培养及免疫荧光检测为对照），特异性达91. 3%（有其他病毒混合感染发生）。
2.6 靶序列富集多重扩增技术 ( target - enriched-multiplexPCR，Tem - PCR)
Tem - PCR是HanJ发明的一种新型多重PCR技术。该技术存在一对通用超级引物（下端标记生物素）和极低浓度的各种靶序列特异性引物（两端带有可被超级引物识别的标签序列）。反应过程中，首先低浓度特异性引物进行靶序列富集，经高浓度超级引物识别后高效指数扩增，并使产物带有生物标记素。与多重PCR比较，该法不易产生二聚体，减少了反应背景噪音。
2.7 多重PCR结合反向斑点杂交技术 (reverse -lineblothybridization，RLB)
RLB技术将探针固定在尼龙膜（或硝酸纤维素膜）上，将带有生物标记素的多重PCR产物与抹上探针特异性结合，利用非放射性的酶显色反应显示杂交结果。通过负压仪器的流过式反向斑点杂交可显著提高反应效率、缩短反应时间。该法有效解决扩增片段大小的局限，减少干扰，大大提高了特异性和敏感性。所需仪器设备价格低，值得在普通实验室推广。
2.8 基因芯片 ( genechip)
基因芯片是近年来生物高新技术领域发展起来的一项技术。原理是将许多特定寡核苷酸片段或基因片段按一定规律排列在支持物上，与带标记的待测样品基因进行杂交，通过采集各采集点的荧光信号，辅以计算机软件进行图像信息分析处理。芯片技术的灵敏度和特异性高、基于高通量的优势，适用于多种病原的鉴别诊断。Raymond F等将此技术对比单- PCR技术，显示二者检测结果有良好一致性。随着技术的不断完善，芯片技术将在疾病诊断、病毒检测方面发挥至关重要的作用。
3 免疫学检测法
3.1 直接免疫荧光法( DFA)
直接免疫荧光法（呼吸道病毒诊断试剂盒为Chemiconlntemationlnc Temecula，CA USA)对呼吸道腺病毒进行抗原检测，是应用将标记的特异性荧光抗体直接加在抗原标本上，经一定温度和时间的染色后荧光镜检的实验原理．标本处理、细胞片制备、染色均按说明操作，结果于荧光显微镜下观察，排除非特异性染色后，以每片不少于5个阳性包涵体细胞为阳性。该方法操作简便、准确性高，是目前病毒抗原检测的主要方法。但对细胞结构完整性要求较高，也容易受检测者主观因素的影响。
3.2 单抗结合碱性磷酸酶一抗碱性磷酸酶桥联技术( Alkalinephosphataseantialkalinephosphatase,APAAP)
APAAP技术采用鼻咽分泌物脱落细胞进行涂片，采用腺病毒单克隆抗体结合抗原后加入相应二抗，最后和APAAP复合物反应。以上各步均采用40¨l的试剂用量，37℃孵育30 min。加坚固红底物工作液37℃孵育15 min，各步间均以TBS缓冲液振荡洗涤3次，每次5 min，最后用苏木素衬染45 s，甘油明胶封片。在普通显微镜下读片，以胞核或（和）胞浆出现玫瑰红为阳性细胞，每张涂片出现两个以上的典型阳性细胞为腺病毒阳性样本。
苏犁云等研究发现，1 12份标本经病毒培养，病毒培养与APAAP法同为阴性者有101例，阴性总符合率为91. 9%；病毒培养与免疫荧光法同为阴性者有106例，阴性总符合率为97.3%。另一方面，112偷标本经病毒培养，有3例确定为腺病毒，直接免疫荧光法共检出6例腺病毒阳性，而APAAP法检出9例，虽然APAAP法检出的阳性例数较免疫荧光法多，但其在3例病毒培养阳性的标本中只检出1例阳性，因而其检出率低于免疫荧光法。但这不能排除由于鼻咽分泌物标本不易处理，APAAP染色本底较高，造成主观判断导致假阳性。相比之下，免疫荧光染色对比强烈，阴、阳性细胞极易辨别，阳性结果清晰。而且直接免疫荧光法较APAAP法在实际检测中更省时、省力，因而更适用于临床，对临床病原学快速诊断有较大价值。
3.3 双抗体夹心酶联免疫法( ELISA) 检测血清HADV - IgM抗体 此方法多采用固相ELISA技术，可定性检测人血清中的特异性HADV - IgM抗体，具体操作程序与结果判读均严格按照试剂盒说明书进行。通常只需15 - 30 min即可读取结果，适用于诊室内即时检测( POCT)。
ELISA法检测病毒IgM抗体，具有敏感性高、特异性强、方便快速的优点，故可对感染者急性期多种病毒的特异性IgM抗体进行同时检测，可尽早为临床提供明确的病原学诊断，使患者得到及时合理的诊治。与病毒分离和逆转录一聚合酶链反应( RT -PCR)检测相比．这种快速检测的方法特异性较好(90% - 95%)，但敏感性不稳定（50% - 70%不等），结果需考虑当地疾病流行状况判定。另外，ELISA法操作简便、设备简单，值得推广应用。
3.4 ELISA法检测人血清嗜酸性粒细胞趋化因子( Eotaxin)含量研究表明，血清中Eotaxin水平可以作为衡量腺病毒感染后呼吸道炎症水平的临床指标。受检者清晨采空腹静脉血5 ml，室温静置60rmn，1 500 r/min离心10 min，血清用于测定Eotax-in。Eotaxin测定严格按说明书（人EotaxinELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，敏感度< 15pg/ml)进行。在450 nm波长处读取结果读盘。直接检测急性呼吸道感染者血清中Eotaxin含量，操作方便而且费时少，有利于临床即时诊疗、预后判断。
本文对先前一些实验室、临床上常用的呼吸道腺病毒检测方法进行了综述。传统的直接检测腺病毒的方法包括病毒分离培养、免疫荧光。虽然分离培养最为直接准确，但耗时太长，对技术水平要求较高，一般适用于实验室研究的免疫荧光法是一种方便快速的检测方法，技术门槛低，应用校广，可为临床早期诊断病原提供有力参考。PCR检测方法简单、快速，灵敏度和特异性都较高，是目前最常用的检测方法。只要目的基因存在，理论上都可用PCR法检出，即使病毒在采样过程已发生一定降解。但由于腺病毒基因多态性强，限制了真正普遍适用的腺病毒PCR检测方法的发展。基因芯片技术在高通量、高灵敏度和特异性方面有着较大的优势，但其技术的局限性和普及性未得到良好解决。检测技术的发展为实现腺病毒高灵敏度及高特异性的检测提供了可能，但如何实现病毒检测的高通量、低成本，仍是值得思考和深入研究的问题。
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