孔雀石绿（malachite green，MG）是一种合成的三苯甲烷类工业染料，以往仅在制陶业、纺织业皮革业、食品着色剂、细胞化学染色剂和指示剂等方面有所使用。自1933年起孔雀石绿开始作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂在水产养殖中出现，而后因为具有价格低廉、效果显著等优点，被广泛应用于预防与治疗各类水产动物的水霉病和对原虫的控制。非洲一些国家还用其控制细菌、绦虫、线虫和吸虫等的感染。20世纪90年代开始陆续有研究表明，孔雀石绿进入人类或动物机体后，可以通过生物转化，还原代谢成脂溶性的无色孔雀石绿（MG），其代谢物在鱼体内的残留时间较长，其化学官能团三苯甲烷已被确认具有高毒性、高残留和“三致”的毒副作用，人食用这些鱼类后身体健康会遭受严重威胁。但是由于孔雀石绿的抗菌效果好，使用方便，价格低廉，而且目前没有有效的替代物，实际上并没有退出渔业市场，目前不少地方在水产养殖和水产品贩运中仍有违规使用的情况。本部分综述了孔雀石绿的理化性质、代谢、毒性、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类化合物的全面了解和残留检测提供参考。
1理化性质
孔雀石绿又称碱性绿、盐基块绿、孔雀绿、苯胺绿或中国绿，是一种具有金属光泽的三苯甲烷结晶体，它是由1分子苯甲醛和2分子N，N-二甲基苯胺在盐酸或硫酸中缩合生成四甲基代二氨基三苯甲烷的隐性碱体后，在酸性介质中被二氧化铅（PbO2）氧化制得的深绿色晶体，因其外观颜色呈孔雀绿而得名。分子式为C23H25ClN2，相对分子质量365，易溶于水、乙醇和甲醇，水溶液呈蓝绿色，最大吸收波长618nm。遇浓硫酸呈黄色，稀释后呈暗橙色；其水溶液加氢氧化钠形成微带绿光的白色沉淀。
自然界中孔雀石绿以多种形式存在，但主要以草酸盐的形式存在于乙酸盐和盐酸盐的混合液中，其中孔雀石绿草酸盐或孔雀石绿盐酸盐在该混合液中的浓度均不低于50%。孔雀石绿盐酸盐是一种工业级化学物质，是在孔雀石绿生产过程中加氯化锌而合成的一种双锌盐。
与其他三苯甲烷一样，孔雀石绿以盐、醇类化合物或假碱化合物形式存在时呈二价阴离子形式，即染料盐和甲醇（或甲碱）。以假碱形式存在的孔雀石绿由于其极高的脂溶性而可能进入细胞中。孔雀石绿的电离常数（pK）是6.90，它在pH为4.0时全部电离、pH为6.9时50%电离、pH为7.4时25%电离，而pH上升为10.1时则不发生电离。
图7-30中列出了孔雀石绿、无色孔雀石绿及一系列脱甲基衍生物的结构式。在水溶液中，孔雀石绿阳离子（有色形式）和活性氢氧根离子结合，生成非离子化的无色醇碱，其具有较高的亲脂性，因而孔雀石绿入侵细胞可能是以醇碱的形式。
2代谢与残留
孔雀石绿作为一种杀菌剂，在水体中能迅速被鱼体吸收，低浓度下可以观察到孔雀石绿溶液很快由绿色变为无色。研究发现，经处理后，鱼体内孔雀石绿残留量（尤其是血浆中的浓度）很快超过水体中孔雀石绿的浓度水平。Plakas等用0.8mg/L孔雀石绿溶液处理斑点叉尾1h后，检测其在肌肉中的残留量为0.10mg/kg；但在处理1h后放入清水中养殖，336h后检测其脂肪组织，孔雀石绿浓度高达26.7mg/kg。
孔雀石绿在生物体内的代谢途径主要有两种：①在还原酶的作用下降解为无色孔雀石绿；②在细胞色素P450的催化下经N-脱甲基作用生成初级和次级代谢产物芳香胺。无色孔雀石绿的代谢途径如下：①在氧化酶的作用下被重新氧化成孔雀石绿；②在甲状腺过氧化物酶（TPO）催化下脱甲基生成初级和次级代谢产物芳香胺，芳香胺再进一步酯化后与DNA反应生成DNA加合物（具体见图7-31）。无色孔雀石绿具有较强的亲脂性，所以残留物在生物体内的代谢和分布主要取决于组织的脂肪含量。无色孔雀石绿的结构与苯胺相似，它是合成孔雀石绿的前体物质，也是工业生成中最严重的污染物。
Poe等于1983年首次报道了孔雀石绿在斑点叉尾体内的吸收和代谢。目前文献报道主要通过血管给药和体外药浴研究孔雀石绿在体内的药动学。
通过血管给药后，血液中孔雀石绿的浓度迅速下降。孔雀石绿在血液中的半衰期为62h，主要代谢为无色孔雀石绿，无色孔雀石绿的浓度随使用孔雀石绿的时间而增长：05h后检测无色孔雀石绿和孔雀石绿，分别为0.875μg/mL和0.599μg/mL；10h后为0.197和0.049μg/mL，此时两者之和约为给药量的70%。
通过水体给药后，血液中孔雀石绿及其代谢产物也迅速增加。给药后1h，孔雀石绿和无色孔雀石绿分别为3.29μg/mL和1.94μg/mL，1d后孔雀石绿减少到最低，而无色孔雀石绿到14d后才降到最低（0.106μg/mL）。给药后1h，肌肉中孔雀石绿和无色孔雀石绿分别为1.18μg/mL和1.45μg/mL，14d后分别为0.012μg/mL和0.518μg/mL。孔雀石绿在肌肉中的消除分两个阶段，半衰期为67h；14h后孔雀石绿还可以检测到但不能定量，无色孔雀石绿在42h后仍能检测到（0.019μg/mL），无色孔雀石绿的浓度占总残留量由0h的49%到14d的80%。无色孔雀石绿的浓度随时间增加逐渐升高，转移鱼到清水中1h后，其浓度最高（2.36μg/mL），半衰期为4.7h，10h后孔雀石绿的浓度下降到0.025μg/mL，而无色孔雀石绿升高到孔雀石绿的30倍。
在肌肉和血液中，无色孔雀石绿的代谢比孔雀石绿要缓慢得多，两者在肌肉中残留时间比血液中更长。其他因素也影响孔雀石绿和无色孔雀石绿的代谢，特别是在脂溶性组织中。从10d到40d，无色孔雀石绿在虹鳟肌肉中的半衰期与肌肉中的脂肪含量高度相关，报道孔雀石绿在虹鳟肌肉中的半衰期约为1.5d，有研究表明，无色孔雀石绿和孔雀石绿在虹鳟肌肉中的半衰期分别为2.8h和10h。色谱分析肌肉中残留发现，孔雀石绿代谢是去甲基的过程。无色孔雀石绿也是孔雀石绿在虹鳟体内的主要代谢物。
孔雀石绿的代谢产物广泛分布于体内各个组织，在排泄组织和脂肪中含量最高；在肌肉和血液中最低。2h后孔雀石绿在脂肪、肌肉、血液中的比例为6.2∶0.72∶1；第14天，比例为157∶4.2∶1。脂肪中总残留随时间的延长而增加，血液中则与之相反，下降速度在所有组织中最快。放射研究显示，孔雀石绿给药后广泛地分布于所有组织中，尤其是肝和主肾，其他鱼中的孔雀石绿在排泄器官组织中也被发现，副肾及其血液与肾相似。脾中含量比副肾和主肾均低。在腹脂中，随时间增加，浓度上升；4h时，脂肪中含量居所有组织之首。放射标记分析表明，暴露1h后，每组鱼的孔雀石绿代谢下降为15%；血液给药18h后，胆囊中检测到＜5%，胆汁中浓度为22.8%，48h后尿囊＜5%。
水体暴露随着pH上升，组织中孔雀石绿和无色孔雀石绿升高。在pH为8时，血清和肌肉中的孔雀石绿和无色孔雀石绿分别是pH为6时的8倍和5倍；当pH为6和pH为7时，在2h内，孔雀石绿和醇式的孔雀石绿达到平衡，pH为8时，在5h内主要为醇式的孔雀石绿，但各个形式孔雀石绿的总量保持不变。随着水体pH的上升，鳗组织中的孔雀石绿和无色孔雀石绿的浓度都显著升高，说明醇式的孔雀石绿比无色孔雀石绿更易被机体吸收。
孔雀石绿、无色孔雀石绿在体内的消除速率与个体解毒能力和脂肪含量有关。孔雀石绿降解为无色孔雀石绿后能在体内蓄积，尤其是在脂肪含量较多的组织中。Plakas分析了孔雀石绿在体内的吸收、组织分布和代谢。在水体中孔雀石绿被快速吸收，短时间内在鱼组织中可检测到孔雀石绿的残留。Alderman报道，孔雀石绿被吸收到鱼的几乎每一个组织中，残留明显并且几乎难以代谢。
鱼类的Ⅰ相去毒酶（细胞色素P450、细胞色素b5和NADPH-细胞色素P450还原酶等）与Ⅱ相去毒酶等一系列代谢去毒酶在清除鱼体内的孔雀石绿中具有重要作用。特别是Ⅱ相去毒酶，它可催化谷胱甘肽与内源或外源毒性物质的加合反应，形成水溶性大、毒性降低的加合物，使有毒物质能随胆汁经消化道分泌排泄或从鳃、肾（尿）中排出体外。Debnam等证实了谷胱甘肽与孔雀石绿结合物在小鼠体内的存在，说明Ⅱ相去毒酶可催化谷胱甘肽与孔雀石绿结合，从而清除体内的孔雀石绿。
孔雀石绿和无色孔雀石绿在体内的消除还受pH、温度、溶氧量等一系列环境因素的影响。特别是pH和温度，一般来说，温度越高，其排出的速率越快；在适宜的pH条件下，鱼体能加快残留药物的清除速率，但总的来说，清除速率是很慢的，尤其是无色孔雀石绿，它在组织中清除的速率更慢。Bergwerff等在温度为23.0~26.5℃、pH为7.0~7.8时，用0.1mg/L孔雀石绿溶液处理幼鳗鲡24h，100 d后，经检测其体内仍有一定的孔雀石绿残留，而且无色孔雀石绿在幼鳗鲡体内的清除速率显著慢于孔雀石绿。由于无色孔雀石绿在组织内清除缓慢，它常被作为检测水产品安全的一项重要指标。
此外，1988年Bumpus和Block首次发现孔雀石绿可被真菌降解，1997年Henderson等报道，孔雀石绿可被肠道微生物降解。2001年Chang等研究发现孔雀石绿可被丝状真菌代谢和降解。
3抗菌机理与用途
3.1抗菌杀虫机理
在细胞分裂时，细胞内的氨基酸必须转化为蛋白肽，否则细胞分裂会受到抑制。而孔雀石绿在细胞分裂时阻碍蛋白肽的形成，产生抗菌杀虫作用。
3.2用途
3.2.1抗寄生虫药
孔雀石绿一般用作体外抗寄生虫药，也可以用于抗皮肤吸虫和腮吸虫。此外，孔雀石绿可用于治疗蟹鱼虱病、孔雀花鳉（古比鱼）的腰鞭毛虫和四膜虫病。
3.2.2抗真菌和细菌病
孔雀石绿被广泛用于抗真菌感染，主要用于预防卵菌纲真菌在鱼体和鱼卵中的生长繁殖，同时可预防和治疗二次感染。在筛选抗卵菌纲真菌的49种化合物时发现，孔雀石绿的抗菌效果最好。孔雀石绿可预防大螯虾的海壶菌病和鲑的镰刀菌病。鲑、淡水鲶和虹鳟的水霉病也可以得到有效控制，一般使用0.15~0.20 g/m3的浓度全池遍洒或用10 g/m3的浓度浸洗15~30min来防治鱼类的水霉病。孔雀石绿对某些鱼类的曲霉菌感染也有不错的疗效。在非洲，孔雀石绿还被用于水产养殖业抗细菌感染的首选药物。
3.2.3用于其他疾病的治疗
对于虹鳟的增生性肾炎、大西洋鲑的皮肤溃疡有很好的控制效果，与福尔马林联合应用对部分原虫和黏细菌感染有很好的控制效果。
0.1%的孔雀石绿在临床上有非常广泛的应用，可用于治疗丘疹性荨麻疹、蚊虫叮咬、血管性水肿等；瘙痒性皮肤病、脓疥疮、毛囊炎等化脓性皮肤病；带状疱疹、单纯疱疹等皮肤病；湿疹、足癣等继发感染引起的脓疽和小片糜烂等皮肤损害，以及冷冻、激光后所致的皮肤损害。
3.2.4孔雀石绿在其他行业中的应用
孔雀石绿还被大量用于食品添加剂、消毒药、驱虫药，并被作为染料用于丝绸业、毛纺业、麻纺业、皮革业、棉纺业、印刷业和丙烯酸工业。
据调查，目前孔雀石绿也作为一种消毒剂被广泛应用，具体为：
（1）运输工具消毒 活鱼贩运商为了延长鱼生存的时间，在运输前用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒。
（2）鱼池消毒 因为鱼从鱼塘到当地水产品批发市场，再到外地水产品批发市场，要经过多次装卸和碰撞，鱼鳞容易脱落。掉鳞会引起鱼体霉烂，使鱼很快死亡，因此储放活鱼的鱼池也采用孔雀石绿进行消毒。
（3）暂养消毒 酒店为了延长鱼的存活时间，也投放孔雀石绿进行消毒。使用孔雀石绿消毒后的鱼即使死亡后颜色也较为鲜亮，消费者很难从外表分辨。
4毒副作用
虽然孔雀石绿可以产生抗菌杀虫的作用，但同时它又产生了极大的副作用。不仅表现为对所治疗的水产动物的毒害作用，而且对人体和哺乳动物的机体也有严重影响。Steffens等早在1961年便提出孔雀石绿是一种高毒性物质。
4.1毒性机理
由图7-30可以看出，孔雀石绿分子中与苯基相连的亚甲基和次甲基受苯环影响有较高的反应活性，可生成自由基三苯甲基，这些孔雀石绿的代谢产物衍生物及初级和次级的代谢产物具有与致癌芳香胺类似的结构，研究证实这类分子进入人体后，会穿透细胞膜，到达细胞核中的DNA，很容易产生活泼的亲电子“阳氮离子”，攻击DNA上的亲核位置，相互以共价键结合，从而破坏DNA，引起癌变。除此之外，芳香胺分子的扁平部分还会“插入”正常细胞中DNA的螺旋线结构的相邻基本对之间，破坏DNA，引起癌变。另外，无色孔雀石绿进一步代谢阻碍甲状腺激素的合成，降低四碘甲状腺原氨酸（T4）、增加甲状腺刺激激素（TSH）浓度，诱发甲状腺细胞肿瘤的生成。
4.2对水生动物的毒性
相关研究表明孔雀石绿的毒性较强，对水生动物的安全浓度较低。如对翘嘴红铂鱼苗、虹鳟鱼苗、加州鲈苗和对虾虾苗的安全浓度分别为0.031mg/L、0.025mg/L、0.02mg/L和0.01mg/L，这比孔雀石绿的有效用药浓度0.10~0.20mg/L低，因此对上述水产养殖动物使用孔雀石绿是不安全的。研究还发现，孔雀石绿和无色孔雀石绿对鱼类的毒性随着暴露时间、温度和浓度的增加而增强，另外毒性也与环境因素，特别是pH、硬度和溶解氧的多少有关。
Gluth和Bills详细研究了孔雀石绿对不同成年鱼和幼鱼的LD50，其范围在0.045~9.100mg/L。影响因素包括pH、水温和染料作用时间。研究表明，水温上升可引起孔雀石绿的毒性作用增强，这与Alderman和Polglase的报道相符。
Wright评价了孔雀石绿对大口鲈和鲑鱼卵及鱼苗的致死率。结果表明，孔雀石绿的浓度增加1倍，其致死率可增加20倍，因而可以认为孔雀石绿是一种剧毒物，应禁止用于大口鲈鱼卵和幼鱼的生产。Wright还研究了孔雀石绿短期或长期暴露于淡水鱼后的毒性影响。孔雀石绿用于虹鳟后可导致基因突变、癌症、染色体破碎、畸形和繁殖能力下降，虹鳟长期暴露于孔雀石绿后发现鱼卵发育异常，受精38h后胚胎存活率显著下降，孵化时间延长，脊柱、头、鳍和尾发育异常。孔雀石绿对呼吸系统酶有毒性影响，可导致虹鳟和罗非鱼的呼吸失调。美国FDA将孔雀石绿列为致癌敏感化合物。
组织病理学研究发现，孔雀石绿对肝、腮、肾、肠、性腺和垂体促性腺细胞有严重的影响；孔雀石绿可导致肝脏局部坏死，引起肾近曲小管上皮细胞的增生、肾小球萎缩、肾被膜破裂、细胞坏死、核破裂、核溶解、核固缩。孔雀石绿也可导致肠坏死与剥落，肠上皮细胞退化，杯形细胞增生；肠绒毛稍破裂，黏膜折叠破裂，肌肉和绒毛膜变形、变性。在急性、亚急性和亚致死浓度下，鲶垂体促性腺细胞活性受到抑制，性腺退化。
血液生理生化研究发现，孔雀石绿可引起虹鳟等鱼类血液参数的变化，如贫血，血球容积、红细胞和白细胞减少，血球蛋白含量降低，血凝固时间延长。淡水鲶暴露于孔雀石绿3d后，红细胞和血红蛋白数增加，白细胞减少。Bills和Hunn否认孔雀石绿会对银大马哈鱼的血液生理生化产生不良的影响，但在急性、亚急性和致死浓度下，还是发现Heteropnerstes fossilis的血液生化参数有明显的变化。在0.1mg/L孔雀石绿中暴露20d，鱼血液中钙和蛋白质含量明显下降，鲶血液总胆固醇含量增加，罗非鱼血液磷和钙含量下降。鲶暴露于孔雀石绿后，碳水化合物和渗透压调节紊乱。孔雀石绿可导致肝脏和肌肉糖分解紊乱，并伴随高血糖和高胆固醇；还导致某些鱼体内缺氧，蛋白质合成能力减弱。
文琛等应用MTT法测定孔雀石绿对鲤上皮癌细胞（EPC）、草鱼肾细胞（CIK）、斑点叉尾卵巢细胞（CCO）的急性毒性。测定孔雀石绿的细胞毒性，发现MTT还原量减少，甲瓒生成量与孔雀石绿浓度存在依赖关系，孔雀石绿浓度越大，活细胞越少，甲瓒生成量也相应减少。以2×104接种量对EPC、CIK、CCO进行24h染毒，发现随着孔雀石绿浓度的增高，细胞存活率减少，而且在3种细胞中，CIK对于孔雀石绿的作用最敏感。
4.3对人和哺乳动物的毒性
孔雀石绿对哺乳动物细胞具有高毒性，孔雀石绿能引起动物食物摄入量、生长速度和生殖能力的降低，导致肝、肾、心脏、脾、肺等脏器中毒，造成皮肤、眼睛、肺和骨骼的损害。Culp等试验发现孔雀石绿与无色孔雀石绿均能使大鼠肝细胞空泡化，无色孔雀石绿还能使甲状腺滤泡上皮大量凋亡，减少公鼠甲状腺激素的释放；还能抑制血浆胆碱酯酶的作用，进而有可能造成乙酰胆碱的蓄积而出现神经症状。
4.3.1急性毒性
孔雀石绿盐酸盐对小鼠经口急性毒性LD50为80mg/kg，孔雀石绿草酸盐对大鼠经口急性毒性LD50为275mg/kg，急性毒性属中等毒物质。
4.3.2遗传毒性
孔雀石绿草酸盐在S-9作用下可致鼠伤寒沙门氏菌T98基因突变。彗星试验结果也发现可诱发中国仓鼠卵巢细胞染色体损伤。尽管体内微核试验未发现致染色体损伤作用，但给予F344大鼠和B6C3F1小鼠9mg/kg、100mg/kg和600mg/kg的孔雀石绿或0mg/kg、96mg/kg和580mg/kg的无色孔雀石绿28d，用32P后标记法在肝脏中检出DNA加合物，但外周血淋巴细胞微核试验和转基因小鼠肝脏凝血抑制因子（lacI）突变试验阴性。
Majanatha等报道给转基因雌性B6C3F1小鼠450mg/kg的孔雀石绿和204mg/kg、408mg/kg的无色孔雀石绿，在4周和16周测定其基因毒性，均未发现外周血淋巴细胞微核和脾中淋巴细胞Hprt突变频率增加，但在16周处理的408mg/kg剂量组，发现无色孔雀石绿增加了肝细胞CⅡ的突变频率，结果表明，无色孔雀石绿的致突变作用主要作用于其靶器官肝脏。
孔雀石绿和无色孔雀石绿的N-去甲基化代谢产物的激活方式与致癌的苯胺类物质类似，由此认为孔雀石绿和无色孔雀石绿在体内和体外均具有致突变作用潜力。此外，孔雀石绿还可诱发叙利亚仓鼠胚胎细胞的恶性转化，并诱导细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的机制与改变P53和bcl-2基因的表达有关。
4.3.3生殖和发育毒性
孔雀石绿对妊娠母兔、大鼠和小鼠都有致畸作用。孔雀石绿可导致妊娠新西兰白兔胎仔发育毒性，子代出现骨骼、心脏、肝和肾发育异常。当孔雀石绿浓度低于0.1mg/mL时，它仍能使兔繁殖畸形。
4.3.4致癌性
早在1958年，Werth等就报道了孔雀石绿可以诱发大鼠肺、胸和卵巢肿瘤。Rao发现其能抑制培养的原始鼠肝脏细胞DNA和EGF的合成，促进乳酸脱氢酶的释放，诱使肝脏肿瘤的发生。Doerge等发现其能阻碍大鼠甲状腺的合成、降低T4、增加TSH浓度，诱发甲状腺细胞肿瘤。Sundarrajan等也发现其能通过促进增殖细胞核抗原和G1/S期细胞周期蛋白的表达，而诱发大鼠肝脏肿瘤。
美国国家毒理学研究中心的研究结果发现，给F344雌性大鼠（每组48只动物）剂量为0.100mg/kg、300mg/kg和600mg/kg（相当于每天0mg/kg、1mg/kg、21mg/kg和43mg/kg）的孔雀石绿104周，与对照组比较，21和43mg/kg剂量组体重增长降低了10%，高剂量组肝相对重量增加。给B6C3F1雌性小鼠（每组48只动物）0mg/kg、100mg/kg、225mg/kg和450mg/kg（相当于每天0mg/kg、15mg/kg、33mg/kg和67mg/kg）的孔雀石绿104周，高剂量组小鼠体重同样降低。给F344雌雄大鼠（每组48只动物）0mg/kg、91mg/kg、272mg/kg和543mg/kg[相当于雄性大鼠每天0mg/kg、5mg/kg、15mg/kg和30mg/kg），雌性大鼠每天0mg/kg、6mg/kg、17mg/kg和35mg/kg）的无色孔雀石绿104周，在高剂量组，雌性体重降低了25%，雄性降低了10%~15%，肝相对重量增加。给B6C3F1雌性小鼠（每组48只动物）剂量为0mg/kg、91mg/kg、204mg/kg和408mg/kg[相当于每天0mg/kg、3mg/kg、31mg/kg和63mg/kg）的无色孔雀石绿104周，在高剂量组，肾相对重量降低。致癌试验结果表明，孔雀石绿可诱发大鼠甲状腺肿瘤、肝肿瘤和乳腺肿瘤，对雄性小鼠未见致癌作用。无色孔雀石绿可致雄性大鼠甲状腺瘤、睾丸癌和雌性大鼠肝肿瘤增加，并可显著诱发小鼠肝肿瘤。此外还有研究报道，孔雀石绿可促进二乙基亚硝胺（DEN）诱发的肝癌前病变增加，其机制与调节细胞周期蛋白D1和相关激酶、cdk4、细胞周期蛋白B1和相关激酶及cdc2基因表达有关。
4.3.5慢性毒性
孔雀石绿还是作用于机体多器官的毒物，动物试验发现孔雀石绿可引起肝、肾、心脏、脾、皮肤、眼睛、肺等多器官毒性。San-dra等在孔雀石绿和无色孔雀石绿的毒性和体内代谢试验中，给予F344雌性大鼠和B6C3F1小鼠1200mg/kg的孔雀石绿或1160mg/kg的无色孔雀石绿28d，孔雀石绿可诱发小鼠膀胱上皮细胞和甲状腺滤泡细胞大量凋亡，大小鼠肝细胞出现空泡。同时，无色孔雀石绿可诱裂Hamster鼠肝细胞，导致甲状腺上皮细胞液泡化，减少甲状腺激素的合成与释放，降低T4水平，增加TSH水平。对血液学参数检测发现，红细胞总数、血红蛋白数量、血细胞比容、平均红细胞浓度显著下降。B6C3F1小鼠血液中红细胞容积和网状细胞数量都增加。此外孔雀石绿能抑制血浆胆碱酯酶的活性，进而造成乙酰胆碱的蓄积而出现神经症状。
4.4对非靶生物的影响
李红霞等考察了孔雀石绿对小球藻和金藻生长的影响，并研究了孔雀石绿对小球藻中叶绿素含量的影响。结果表明，孔雀石绿对两种藻类的生长具有较强的抑制效应，96h的半抑制效应浓度（EC50）分别为0.133mg/L和0.017mg/L，属于高毒，而且对金藻的毒性大于小球藻，小球藻中叶绿素b和类胡萝卜素的含量随孔雀石绿浓度的增加而明显下降。
5国内外限量要求
美国、欧盟、加拿大等已经将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。加拿大于1992年就禁止其作为渔场杀菌剂；美国规定在食用水产品中禁止检出孔雀石绿和无色孔雀石绿；欧盟于2002年6月颁布法令禁止在渔场中使用孔雀石绿。而我国也于2002年5月将其列入«食品动物禁用兽药及其化合物清单»，禁止用于所有食品动物。
6样品前处理
如前所述，孔雀石绿在水产品生物中主要以无色孔雀石绿形式存在，并且具有很好的亲脂性。而水产品基质化学成分复杂，脂肪含量较高，不利于目标分析物的提取和净化。
大多数研究者都采用乙腈、乙酸胺盐等缓冲溶液来提取孔雀石绿及其代谢物，然后离心分离，经过液-液萃取、固相萃取等净化技术来获得。
6.1提取
孔雀石绿易溶于水，样品中以阳离子形式存在。无色孔雀石绿极性弱，易溶于有机溶剂。一般采用的提取溶液为甲醇和乙腈，由于甲醇对样品基质成分具有较强的溶解性，提取液干扰成分多，一般选用乙腈作为提取溶液。提取时常加入离子对试剂对甲苯磺酸，有利于孔雀石绿及无色孔雀石绿形成离子对，增加乙腈对这两种物质的提取效率，提取溶剂中水相和乙腈的比率也影响样品的回收率。根据相关文献报道，目前主要采用的缓冲盐体系有Mcllvainer缓冲液（pH3.0）、乙酸铵缓冲液（pH4.5）以及2%的三氯乙酸、6%的高氯酸和10%的磷酸的缓冲液体系，它们的主要作用就是使样品可食性组织中蛋白质变性，从而使目标化合物能够很好地被提取出来。吴学立对三种缓冲液体系做了对比研究，结果表明Mcllvainer缓冲液（pH3.0）对孔雀石绿及其代谢物无色孔雀石绿有非常稳定的提取效果和较好的回收率，其绝对回收率达到50.4%；使用乙酸铵缓冲液（pH4.5）也有比较好的回收率，其绝对回收率达到45.8%；而使用2%的三氯乙酸、6%的高氯酸和10%的磷酸的缓冲液体系则回收率偏低，仅为24.6%。
孔雀石绿及其代谢物无色孔雀石绿不稳定，容易发生降解，特别是无色孔雀石绿，这种降解最有可能是去甲基化而变成N，N′，N″-三甲基或N，N′-二甲基的化合物。样品提取时常加入还原剂有助于防止待测物的降解。根据文献报道，目前使用的还原剂主要有盐酸羟胺、TMPD（N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺盐酸盐）及抗坏血酸。吴学立对三种还原剂做了对比试验，结果显示加入三种还原剂均可以减少损失、提高分析物回收率。加入TMPD分析物回收率稍高于盐酸羟胺及抗坏血酸，但差异不显著。
詹月华等通过L9（34）正交试验确定了水产品中孔雀石绿残留的最佳提取剂配方及提取技术：在5g鱼肉样品中分别加入酸性氧化铝2.0g、PbO2和硅藻土混合物（1∶2）0.6g、pH3.5乙酸盐缓冲溶液7.5mL、1mol/L的对甲苯磺酸溶液2.5mL、乙腈10mL，经充分研磨、匀浆之后，3 000r/min离心取上清液。
6.2净化
上述提取液经过二氯甲烷萃取后，去除了盐等水溶性物质，但仍含有油脂、色素等基体。这些基体对检测有非常大的干扰。许多研究通常采用氧化铝及固相萃取（SPE）等技术达到净化提取液的目的。
相关文献报道，目前大多采用酸性氧化铝、碱性氧化铝来吸附提取液中的杂质，吴学立在提取过程中加入氧化铝脱脂对草鱼、鳗、虾及贝有非常显著的效果，但对三文鱼效果不显著。这可能是因为三文鱼的油脂、色素含量要高于草鱼、鳗、虾及贝。同时对酸性氧化铝、碱性氧化铝及中性氧化铝都进行了对比试验。结果显示碱性氧化铝对杂质的吸附效果稍好于其他两种氧化铝。氧化铝在提取液中存在一个动态平衡，它在对杂质的吸附过程中同时也对目标化合物进行吸附，但对杂质吸附效果大于目标化合物时，回收率显著增加；当对杂质吸附效果小于对目标化合物时，回收率显著降低（图7-32）。
样品处理过程复杂，步骤较多，其中重要一环是SPE。SPE的基本原理与液相色谱分离机理相似系根据被萃取组分与样品基质及其他成分在固定相填料上作用力强弱的不同而使它们彼此分离。而SPE主要是依靠SPE柱来纯化，不同的SPE柱的回收率差别较大。对孔雀石绿及无色孔雀石绿的净化主要有阳离子交换柱、氧化铝柱等，目前研究方法中基本使用阳离子交换柱进行净化。Bergwerff等对不同规格不同品牌的阳离子交换柱进行比较试验，试验结果显示Aromatic sulfonicacid柱及Sulfonic acid柱（均来自Baker），SCX柱（来自IST），SCX柱（来自Varian）这四种柱子对孔雀石绿回收率范围在33%~54.6%，对无色孔雀石绿回收率均超过91%，而SupelcleanLC-SCX（来自Supelco）、SCX（来自Merck）这两种柱子对孔雀石绿和无色孔雀石绿的回收率都非常低，基本不保留。张志刚等使用OasisMCX柱对孔雀石绿回收率超过83%，对无色孔雀石绿回收率超过78%，并且净化效果较好。吴学立选择了OasisMCX以及OasisWCX阳离子交换柱这两种适应碱性化合物净化的SPE柱来进行净化试验。结果显示MCX柱对孔雀石绿和无色孔雀石绿有非常好的保留，并且回收率都超过91.4%，而WCX柱对孔雀石绿保留较差，回收率低，对无色孔雀石绿保留较好。
邱绪建用国产732阳离子树脂、硅胶和PRS（丙基磺酸型阳离子树脂）分别进行试验。结果发现国产732阳离子树脂虽然可吸附孔雀石绿，但无法将其洗脱，1mol/L氯化钠溶液、100%甲醇、乙腈均不能使其洗脱。采用硅胶虽然可以吸附孔雀石绿并使其洗脱，但是回收率太低，小于50%。对于无色孔雀石绿，硅胶不能吸附无色孔雀石绿；采用国产阳离子树脂，无色孔雀石绿的回收率太低。
PRS是一种阳离子树脂，其结构有其特殊性，它的结构如下：
PRS是一种较好的树脂，能吸附和解析所检物质，经试验发现回收率较高而且纯化效果好。Thompson等和Plakas等均采用丙基磺酸型的SPE柱来纯化。
6.3几种样品处理方法
6.3.1 水产品中孔雀石绿残留量的测定（GB/T19857—2005）
6.3.1.1鲜活水产品
提取：称取5.00g已捣碎样品于50mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液，加入11mL乙腈，超声波振荡提取2 min，8 000r/min匀浆提取30s，4 000r/min离心5min，上清液转移至25mL比色管中；另取一50mL离心管加入11mL乙腈，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，涡旋混匀器上振荡30s，超声波振荡5min，4 000r/min离心5min，上清液合并至25mL比色管中，用乙腈定容至25.0mL，摇匀备用。
净化：移取5.00mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上，用KD浓缩瓶接收流出液，4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至约1mL，残液用乙腈定容至100mL，超声振荡5min，加入1.0mL5mmol/L乙酸铵，超声振荡1min，样液经0.2m滤膜过滤后上机测定。
6.3.1.2 加工水产品
提取：称取5.00g已捣碎样品于100mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液，依次加入1mL盐酸羟胺、2mL对甲苯磺酸、2mL乙酸铵缓冲溶液和40mL乙腈，匀浆2min（10 000r/min），离心3min（3 000r/min），将上清液转移到250mL分液漏斗中，用20mL乙腈重复提取残渣1次，合并上清液。于分液漏斗中加入30mL二氯甲烷、35mL水，振摇2min，静置分层，收集下层有机层于150mL梨形瓶中，再用20mL二氯甲烷萃取1次，合并二氯甲烷层，45℃旋转蒸发近干。
净化：将中性氧化铝柱串联在阳离子交换柱上方。用6mL乙腈分3次（每次2mL），用涡旋振荡器涡旋溶解上述提取物，并依次过柱，控制阳离子交换柱流速不超过0.6mL/min，再用2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后，弃去中性氧化铝柱。依次用3mL2%（V/V）甲酸溶液、3mL乙腈淋洗阳离子交换柱，弃去流出液。用4mL5%（V/V）乙酸铵甲醇溶液洗脱，洗脱流速为1mL/min，用10mL刻度试管收集洗脱液，用水定容至10.0mL，样液经0.2μm滤膜过滤后上机测定。
6.3.2水产品中孔雀石绿残留量的测定———高效液相色谱荧光检测法（GB/T 20361—2006）
提取：称取5.00g样品于50mL离心管内，加入10mL乙腈，10 000r/min匀浆提取30s，加入5g酸性氧化铝，振荡2min，4 000r/min离心10min，上清液转移至125mL分液漏斗中，在分液漏斗中加入2mL二甘醇、3mL硼氢化钾溶液，振摇2min。
另取50mL离心管加入10mL乙腈，洗涤匀浆机刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，加入3mL硼氢化钾溶液，用玻棒捣散离心管中的沉淀并搅匀，涡旋混匀器上振荡1min，静置20min，4 000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中。
在50mL离心管中继续加入15mL盐酸羟胺溶液、2.5mL对甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸铵缓冲溶液，振荡2min，再加入10mL乙腈，继续振荡2min，4 000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中，重复上述操作1次。
在分液漏斗中加入20mL二氯甲烷，具塞，剧烈振摇2min，静置分层，将下层溶液转移至250mL茄形瓶中，继续在分液漏斗中加入5mL乙腈、10mL二氯甲烷，振摇2min，把全部溶液转移至50mL离心管，4 000r/min离心10min，下层溶液合并至250mL茄形瓶，45℃旋转蒸发至近干，用2.5mL乙腈溶解残渣。
净化：将PRS柱安装在SPE装置上，上端连接酸性氧化铝SPE柱，用5mL乙腈活化，转移提取液到柱上，再用乙腈洗茄形瓶2次，每次2.5mL，依次过柱，弃去酸性氧化铝柱，吹PRS柱近干，在不抽真空的情况下，加入3mL等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液，收集洗脱液，乙腈定容至3mL，过0.45μm滤膜后上机测定。
刘少彬等在实际检测中发现，GB/T 20361—2006中的高效液相色谱荧光检测器法存在回收率差异大、分层有时不明显，基线噪声不稳定等缺陷，针对这些问题提出了一些改进的建议。
如前所述，GB/T 20361—2006方法中是先加入10mL乙腈，提取后加入酸性氧化铝振荡离心，上清液移入分液漏斗中，在分液漏斗中加入硼氢化钾振荡。实际检测中发现，在第一步乙腈提取液中加入硼氢化钾，静置还原后接着加入酸性氧化铝，既可有效地使孔雀石绿得到充分还原，而且又可以有效地去除大分子脂肪和促进层析。这就减少了加乙腈提取后在分液漏斗中加硼氢化钾振荡还原这一步，既缩短了检测时间又减少了乙腈的试剂用量，依然保证了较高回收率。
GB/T 20361—2006中是直接加入20mL二氯甲烷来进行萃取，但分层缓慢，且会出现有几层有时忽上忽下的现象，如果样品油脂含量较高，容易出现乳化现象。若在分液漏斗中先加入10mL水，加入少量氯化钠，改进方法的回收率及精确度试验分层明显。原因是加入水可洗去萃取液中水溶性杂质，利于分层，而少量氯化钠可防止大面积乳化现象发生。
净化过程中，在移除酸性氧化铝柱后，建议比GB/T20361—2006多加一步骤，用3mL水淋洗PRS柱。结果表明，加水淋洗PRS柱可有效去除停留在PRS上的水溶性杂质而又不影响待测物孔雀石绿，有效降低基线噪声，大大提高回收率。
杨贤庆等在实际检测中发现，GB/T 20361—2006中，在鱼肉前处理过程，为了将孔雀石绿完全还原，多次加入硼氢化钾，使试验操作繁琐复杂。为了确定硼氢化钾的还原效果，杨贤庆等通过试验，得出2.4μg孔雀石绿被完全还原仅需要硼氢化钾15μg，由此说明硼氢化钾的还原效果非常好，但硼氢化钾在酸性条件下反应产生氢气，所以在乙酸铵缓冲液体系下，还原效果很差。另外，如果硼氢化钾在对甲苯磺酸之后加入，硼氢化钾也会与对甲苯磺酸发生反应，因为对甲苯磺酸呈弱酸性。故采取在浓缩后加入0.1mL的硼氢化钾还原，而避免在前处理酸性环境下加入，影响其还原效果，从而避免了前处理过程中多次加入的繁琐。
6.3.3水中孔雀石绿的样品处理方法
刘桂花等建立了水中孔雀石绿和无色孔雀石绿的同位素内标稀释LC-MS/MS，方法简单，主要利用离子交换柱高度富集浓缩水中待测物，水样中加入氘代同位素内标，经SCX柱提取和净化。
样品处理：量取100mL鱼池水样加入50μL浓度为100ng/mL的混合内标，转移至先用5mL乙酸-乙腈（5∶95，V/V）溶液活化过的AgilentSCXSPE小柱上，以流速1~3mL/min过柱。待水样全部过完柱后依次用25mL丙酮、5mL甲醇和5mL乙腈淋洗。用10mL氨水-乙腈（5∶95，V/V）溶液洗脱小柱，收集洗脱液在40℃下用氮气吹至0.5mL，加入0.5mL 2mmol/L乙酸铵溶液，涡旋混匀15s，过0.45μm有机系微孔滤膜备用。
7检测方法
根据目前各类检测方法的不同检测原理，分为化学分析法和免疫化学法两大类。
7.1化学分析法
7.1.1分光光度法
分光光度法是分析鉴定中常用的方法，快速简便，但该方法灵敏度低，对目标化合物不能分离定量，准确性较差，在低浓度水平的复杂基质中，检测结果假阳性概率高。以往研究报道仅限于水样的检测，且仅用于孔雀石绿原料药等的测定，检测限为0.5~1μg/L。Safarik等曾用普通分光光度法检测水样中孔雀石绿含量。
近几年也有水产品中孔雀石绿检测的相关报道。林谦等用乙腈溶解孔雀石绿固体，采用紫外分光光度法检测水产品中孔雀石绿的含量。试验证明孔雀石绿的最佳吸收波长为619nm，该方法的最低检出限为0.02μg/mL，回收率可达到93.6%~99.0%。黄宝美等采用紫外可见分光光度法对鱼体中孔雀石绿残留量进行了测定。试验证明最佳吸收波长617.4nm，最低检出限为0.1mg/L，样品加标回收率为96%~99%。
虽然分光光度法简便、快速、准确，回收率高，成本低，但由于该方法灵敏度较差，无法有效监控禁用药物孔雀石绿的使用，不适用于水产品中孔雀石绿残留的检测。
7.1.2 薄层色谱（TLC）
TLC也是理化分析中较常见的方法之一，已有几十年的应用历史。该法采用层析分离原理，利用目标化合物的荧光特性进行定性定量检测。该法分离孔雀石绿灵敏度较低，定量误差范围大，同时还要求被检样液中的目标化合物浓度高。该方法主要用于孔雀石绿药物的鉴定和具有高残留量基质中孔雀石绿的定性测定，不适于动物源性食品中孔雀石绿残留量的检测要求。Edelhaeuser等曾用TLC检测孔雀石绿，在硅胶薄层板上涂荧光指示剂，用于样品检测。该法虽然简便快速，但不能同时检测孔雀石绿和无色孔雀石绿。与HPLC相比，TLC灵敏度较低，一般只做定性分析，很少用于残留检测。
7.1.3共振瑞利散射法
共振瑞利散射法的工作原理是利用待测物与配体缔合后，生成的缔合物因疏水作用聚集形成纳米粒子，能产生强烈的共振散射，从而对待测物进行定性、定量分析。
范翔等研究发现，在硫酸介质中，孔雀石绿与磷钼酸根阴离子形成离子缔合物而产生共振瑞利散射，建立了以磷钼酸根阴离子为载体，共振瑞利散射测定痕量孔雀石绿的新方法。方法的线性范围为0.18~5.0μg/mL，检出限为55ng/mL，水样和水产品添加回收率分别为88.7%~106.5%和87.4%~95.5%。范翔等还发现，在弱酸性介质中，孔雀石绿与I3－形成离子缔合物，并进一步聚集成纳米粒子，在波长468nm处，激发产生强烈的共振瑞利散射。据此建立了I3－共振瑞利散射法测定孔雀石绿。在0.012~0.9μg/L范围内，共振光强度与孔雀石绿的含量呈线性关系，建立了共振瑞利法测定孔雀石绿的新方法，检出限为.36g/L，样品添加回收率在87.0%~99.6%。
喻丽红等研究发现孔雀石绿与磷钼酸根阴离子在硫酸介质中形成离子缔合物而产生共振瑞利散射，在pH4.4的HCl-NaAc缓冲介质中，孔雀石绿以及钨酸盐溶液自身的共振瑞利散射均十分微弱，但是当孔雀石绿染料阳离子与钨酸根形成缔合物时，共振瑞利散射急剧增强，并出现新的共振瑞利散射光谱，其共振瑞利散射峰分别位于339nm、451nm和591nm处，其中最大散射波长在339nm处。孔雀石绿浓度在0.06~2.8μg/mL范围与散射增强呈良好线性关系，方法检出限为18.1ng/mL。
共振瑞利散射法分析速度快，仪器设备简单，分析成本低，回收率高，样品添加回收率为87.0%~99.6%，相关报道最低检出限虽然可达到3.6μg/L，但相对LC-MS/MS，其灵敏度相对较低，且该方法不能用于测定无色孔雀石绿的残留，因此也不适用于日常对水产品中孔雀石绿的监控。
7.1.4 Na -Ti（SO4）2法
该方法为普通的化学方法，主要基于孔雀石绿的本身特有的化学性质来检测孔雀石绿。其工作原理是鉴于孔雀石绿与硫酸钛在浓硫酸存在的情况下能发生特异性结合，且其他物质不能与硫酸钛结合，在Na＋存在下孔雀石绿能与硫酸钛的结合物发生沉淀，从而通过1∶1的比例间接计算出结果。钱科蕾等首次建立了用Na＋-Ti（SO4）=法检测鲫组织中孔雀石绿残留的方法。将孔雀石绿溶于浓硫酸显黄色，稀释后显暗黄色，用Ti（SO4）2使其褪色，加入Na＋变为白色沉淀，依据沉淀量对孔雀石绿残留进行定量测量并采用正交试验优化试验条件。结果显示，pH为7.4，硫酸钛和氯化钠的浓度均为2.0mol/L时，可有效地检测孔雀石绿残留。该方法最低检测限为0.01mg/kg，在鲫肌肉和肝脏中的回收率分别为86.63%~91.31%和76.63%~78.08%，相对标准偏差分别为4.21%~2.19%和3.93%~1.86%。该方法具有试验成本低、操作简单、快速等优点，但仅适用于检测水产品中孔雀石绿残留，无法检测其代谢物无色孔雀石绿，不适用于对孔雀石绿的日常监控。
7.1.5 GC-MS
无色孔雀石绿是易挥发的有机物，可以利用这一特性用GC-MS检测无色孔雀石绿。由于无色孔雀石绿在动物体内代谢速度慢，残留期长，阳性样品主要是无色孔雀石绿残留，因而采用GC-MS对水产品中无色孔雀石绿残留进行定性检测也具有重要意义。用GC-单四极杆质谱检测无色孔雀石绿，选用12.5mHP-1毛细管柱分离，MS检测器以SIM监测4个离子，进行定性定量分析，GC毛细管柱分离度高，检测结果背景干扰小，检测灵敏度和定性准确性都能满足检测要求。但该法不适用于沸点较高的孔雀石绿的残留检测。
7.1.6 HPLC
孔雀石绿的沸点高，不易挥发，适合采用LC法进行分析鉴定。据Hajee研究，采用正相的氰基（—CN）柱或反相的C18柱都可以实现分离，反相柱的柱效和分离度较好。目前采用C18反相柱分离方式是主流。
要实现同时对孔雀石绿和无色孔雀石绿两种化合物进行检测，主要利用孔雀石绿和无色孔雀石绿的光学特性，孔雀石绿在618nm处有吸收峰，可采用紫外可见检测器检测；而无色孔雀石绿的吸收峰在267nm，同时还具有荧光特性（激发波长265nm，发射波长360nm），因而可采用紫外或荧光检测器（FLD）检测。具体有以下4种主要检测方式。
7.1.6.1 紫外检测器（UVD）检测
检测孔雀石绿常选用二极管阵列检测器（DAD）和UVD。根据出峰时间的不同，用UVD在618nm处检测孔雀石绿，在267nm处检测无色孔雀石绿，两者的最低检测限均为2μg/kg。该方式的缺点主要在于很多有机小分子在267nm处都有吸收，因此无色孔雀石绿目标峰附近干扰峰较多，该方法用于无色孔雀石绿定性和定量的准确性不够理想。
对于618nm的工作波长，DAD的光源稳定性大大优于UVD，究其原因是带氘灯的UVD在该波长条件下能量降低，而且不稳定。DAD可以在其他无吸收波长区域选择一个参比波长如730nm，有助于降低检测基线噪声，而且可以得到样品在多个波长或者一个区域的吸收光谱图，可以进行峰纯度检验。DAD还可以通过优化来提高检测性能。首先做一个400~900nm的吸收扫描，确定618nm为最大吸收波长，然后以618nm为中心，10nm宽度为检测波长区域；以730nm为中心，50nm宽度为参比波长区域。上述DAD的优化设置条件下的检测会大大优于UVD的单波长检测。
李永夫等利用DAD的优点，以乙腈-0.05mol/L乙酸钠（55∶45）为流动相，以618nm为检测波长，建立了用DAD检测的HPLC法。该方法对孔雀石绿和无色孔雀石绿的检测限分别为1μg/kg和2g/kg，加标回收率分别为85.7%~89.7%和87.6%~91.2%。
7.1.6.2 UVD和FLD串联检测
Mitrowska等没有使用氧化铅柱，而是联合利用UVD和FLD，经HPLC分离后分别对孔雀石绿和无色孔雀石绿进行检测。该方法充分利用UVD和FLD的优点，采用UVD在618nm外检测孔雀石绿，FLD则采用激发波长（265nm）、发射波长（360nm）检测无色孔雀石绿。该方法对无色孔雀石绿和孔雀石绿的灵敏度分别达0.5μg/kg和2μg/kg。此方法虽然检出限达到要求，但无法对阳性结果进行确证。
7.1.6.3 FLD检测
GB/T20361—2006采用这种检测方法，在样品前处理过程中加入硼氢化钾，将孔雀石绿还原成无色孔雀石绿，然后采用FLD进行定量检测。该方法利用了无色孔雀石绿的荧光特性和FLD的高灵敏度、选择性，有效地提高了检测灵敏度，检出限可达05μg/kg。该方法不足之处是对样品前处理要求较高，在处理过程中很难保证所有的孔雀石绿都转化成无色孔雀石绿，影响方法的稳定性。
Roybal、Hajee、Bergwerff分别对鲇肌肉组织，鳗血浆中，鲇、鳗鲡、鲑、大菱鲆、对虾中孔雀石绿及无色孔雀石绿残留进行了研究，检测限为23μg/kg、21μg/kg，5μg/kg、0.9μg/kg，1μg/kg、1μg/kg，回收率分别为72.9%、87.4%，82%、83%，43.8%~67.0%、86%~105%。郭德华用HPLC（—CN柱）对鳗组织中的孔雀石绿残留进行了检测，检出限为1μg/kg，回收率为93.5%~99.6%。郑斌等建立了用HPLC-FLD法测定鳗鲡中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法。样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物无色孔雀石绿或隐色结晶紫，用乙腈、乙酸铵缓冲溶液提取、二氯甲烷液-液萃取、PRSSPE柱净化、反相色谱柱分离、FLD检测、外标法定量。孔雀石绿和结晶紫混合标准工作溶液质量浓度范围为1~600μg/L时，该方法的线性关系极好，相关系数均为0.999 9。该方法定量检出限为0.4μg/kg。当空白样品中孔雀石绿和结晶紫添加水平为0.4~100μg/kg时，孔雀石绿回收率为70.0%~90.6%，结晶紫回收率为73.0%~87.2%，相对标准偏差均小于10%。
7.1.6.4 柱后衍生UVD检测
该方法是我国现行的水产行业标准和国家标准采用的检测方式，目前国内各政府部门的检测机构和生产加工单位普遍采用该检测方法。其原理是利用PbO2将无色孔雀石绿氧化成孔雀石绿，然后在618nm处检测，该方法对孔雀石绿检测限和无色孔雀石绿的检测限分别为4μg/kg和2μg/kg，该方法定性和定量的准确性都比较理想。
余培建建立了用HPLC检测底泥中孔雀石绿及其代谢物的方法。孔雀石绿的回收率为75.2%~79.1%，无色孔雀石绿的回收率为81.1%~84.2%，检测限均为5μg/kg。朱蕾在«水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定»（GB/T 19857—2005）的基础上，对该方法进行了改进，使得方法简便，定量准确，精密度高，更适合于水产品中孔雀石绿及其代谢物无色孔雀石绿残留量的检测。马合勤等采用柱后衍生UVD测定了鱼体组织中孔雀石绿及其代谢物无色孔雀石绿的残留量，方法检出限为2μg/kg，孔雀石绿的回收率为91.8%~99.87%，无色孔雀石绿的回收率为78.02%~94.97%。孔雀石绿的相对标准偏差为0.89%~2.09%，无色孔雀石绿的相对标准偏差为1.27%~34.1%。施彩仙等采用SunFireC18色谱柱、氧化铅柱和DAD在619nm处，以乙腈-0125mol/LpH45乙酸铵溶液（80∶20，V/V）为流动相进行测定，孔雀石绿和无色孔雀石绿平均回收率为89%~107%，相对标准偏差为4.7%~6.1%。
但这种检测方法有很大的局限性，首先每次分析前必须在色谱柱后接上氧化柱，使无色孔雀石绿在氧化柱内继续氧化成孔雀石绿及其他衍生物，有可能出现组分间的相互作用，并且氧化柱中填料二氧化铅和硅藻土的氧化还原反应性能会逐渐减弱，直接影响柱子的寿命；而且柱后衍生容易造成柱后死体积增大，影响色谱分离效果。其次无色孔雀石绿是以孔雀石绿的形式经UVD检测。与高灵敏度的FLD相比，作为水产品中的主要代谢产物，检出限也很难满足要求。
7.1.7 LC-MS检测法
HPLC法的优势在于能对目标物进行定量分析，但并不能对检测结果给出可靠的定性结果，存在假阳性风险，一般还需要以MS进行定性分析确证。以LG-MS检测孔雀石绿，应用反相色谱柱分离目标化合物，分离原理与HPLC法相同，再运用MS检测的高选择性，进一步提高定性定量检测的准确性和灵敏度；此外，还可以用氘代孔雀石绿和氘代无色孔雀石绿为内标进行内标法检测，降低由于前处理过程中目标化合物的损失所带来的偏差，从而提高定量的准确性。
7.1.7.1单四极杆质谱
以单四极杆为检测器的LC-MS仪属于低分辨率质谱（质量分辨率只能达到0.5Da），检测结果背景干扰大，在低浓度水平的复杂基质中，阳性结果较难确证，故该方式不常用。
7.1.7.2离子阱质谱
离子阱质谱也属于低分辨率质谱，虽然它可以通过多级质谱来提高其定性的准确性，但仪器本身固有的质量歧视效应（1/3质量效应）、空间电荷效应、定量线性范围窄、质量准确度差等缺陷导致其定性和定量的准确性都不高。
吴学立等使用LC-线性离子阱-MS/MS技术和同位素稀释技术，以McIlvaine缓冲液和乙腈提取，OasisMCXSPE柱净化，洗脱液在SRM下测定，方法的检出限为0.03~0.05μg/kg，定量限为0.05~0.09μg/kg，5个不同加标水平鱼样中4种目标化合物的平均回收率为84.7%~105.1%，RSD为1.3%~14.9%（n＝5）。研究结果表明其灵敏度比三维离子阱可提高一个数量级。
丁涛等利用HPLC-MS/MS方法快速、准确地同时测定鳗中孔雀石绿、无色孔雀石绿残留量。鳗样品经乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取，LC分配到二氯甲烷层，MCX阳离子SPE小柱净化，浓缩定容。以甲醇和甲酸缓冲溶液为流动相，经C18柱分离后，并用MS/MS在电喷雾（ESI＋）-SRM的模式下，以氘代无色孔雀石绿为内标，进行MS定性和定量。该方法检测限为0.2μg/kg，定量下限达0.5μg/kg，完全可以满足欧盟和日本的相关限量要求。
7.1.7.3飞行时间质谱
飞行时间质谱属高分辨率质谱，其质量分辨率可达到1mDa，它的高质量选择性有效地降低了背景干扰，定性定量准确性得到提高，该方法能满足各国相关法规对孔雀石绿检测的要求。主要在样品分析中，选择2个监测离子，其中1个离子用于定量、1个离子用于确证。
7.1.7.4串联四极杆质谱
该方法是国家标准的检测方法，也是目前各国进出口检验部门普遍采用的检测方法。应用三重四极杆MRM定量分析的功能：第一级四极杆挑选出监测离子，第二级四极杆进行碰撞反应，第三级四极杆挑选出2个监测离子，其中1个离子用于定量、1个离子用于确证。该仪器通过第一级四极杆的离子选择，有效地降低了背景的干扰，极大地提高了灵敏度和定性准确性。
王鹏等采用LC-MS/MS建立水产品中孔雀石绿及其无色代谢物残留的检测方法，均质后的水产品样品用乙腈和乙酸铵缓冲液提取，合并提取液，用二氯甲烷反提取，经中性氧化铝柱和PRS柱SPE净化，不使用氧化铅柱在线氧化，色谱分离后直接进入MS/MS检测器，采用电喷雾（ESI）正离子扫描模式、MRM方式检测，外标法定量。孔雀石绿和无色孔雀石绿的检出限为0.5ng/g，线性方程的相关系数大于0.99，在添加浓度0.5~2.0ng/g范围内，孔雀石绿回收率为78.4%~92.1%，无色孔雀石绿回收率为82.4%~98.1%，相对标准偏差（RSD）均小于5.7%。刘桂华等建立了用同位素内标稀释技术测定水中孔雀石绿及其代谢物无色孔雀石绿的HPLC-MS/MS法。在水样中加入氘代同位素内标，经SCX提取和净化后，用MRM方式检测。方法的线性范围为0.2~5μg/L，孔雀石绿和无色孔雀石绿的检出限均为1μg/L，回收率为93.6%~107.5%，RSD为3.0%~9.3%。蔡泓等建立了一个简便快速的初筛方法。采用乙腈一次萃取，标准系列加入阴性样品中，与待测样品相同步骤、相同条件下操作，结果加标回收率为68.4%~108%；相对标准偏差为5.9%~10.8%，孔雀石绿及代谢物的定量限（LOQ）分别为0.50μg/kg和0.20μg/kg，检出限（LOD）分别为0.16μg/kg和0.07μg/kg。样品从前处理到测定完成只需要30~40min，节省了大量的时间、人力、物力，适用于日常的大批量样品检测。郭德华等利用HPLC-VIS和Q-TOF-MS技术分别建立了HPLC（初筛法）和HPLC-MS/MS法（确证法）两种检测方法。试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，用乙腈再次提取后，液-液分配到二氯甲烷层，最后用丙磺酸SPE小柱净化，洗脱液上机测定，其中的无色孔雀石绿用PbO2衍生柱还原为在可见光处可检测的孔雀石绿，外标法定量。对呈阳性的样品用HPLC与Q-ToF-MS联用进行确证。HPLC-VIS条件，色谱柱1：Kromasil KR60-5CN，150mm×4.6mm，10μm，在CN柱和检测器之间连接25% PbO2氧化柱；流动相：乙腈-乙酸盐缓冲液（55∶45，V/V）；流速：2.0mL/min；柱温：室温；检测波长：618nm；进样量：50μL。HPLC-MS/MS条件，色谱柱2：TSK-GELODS，250mm×20mm，在色谱柱和检测器之间连接25%PbO2氧化柱；流动相：0.05mol/L乙酸铵（pH4.5）-乙腈（25∶75，V/V）；流速：0.2mL/min；柱温：室温；进样量：50μL；电离方式：ESI＋；毛细管电压：2.9kV；锥体电压：55V；离子源温度：120℃；干燥温度：350℃；雾化气流量：90L/h；干燥气流量：490L/h；碰撞能量：27eV；测定方式：TOF；母离子（m/z）：329，碎片离子（m/z）：313，208。并探讨了不同参数（毛细管电压、锥体电压和碰撞电压等）对测定结果的影响。结果表明，随着毛细管电压的增大，孔雀石绿的电离急剧增大，信号响应值增加，电压达到2.9kV时达到最大值，随后趋于平缓。锥体电压的变化对孔雀石绿的响应值影响不大。碰撞能量到达27eV后，在分子离子峰[M＋]产生断裂形成特征性碎片离子基础上，响应值达到最大。
7.2免疫分析法
免疫分析法包括酶免疫检测技术（EIA）、放射免疫法（RIA）、免疫荧光技术（IFT）、免疫电镜技术（IEM）、免疫胶体金技术（ICT）等，是利用抗原与抗体间的特异性反应原理为基础来对某种物质进行定性或定量测定的一种方法。该方法特异性强、灵敏度高（检测限可达0.1ng/mL）、操作简便快捷、分析容量大、检测成本低，不需要贵重仪器，前处理过程可大大简化甚至省去，对试验人员的技术水平要求不高，尤其适宜现场筛选和大量样品的快速分析。以该方法为基础开发的一系列检测产品，如ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、免疫传感器等可广泛应用于现场样品和大量样品的快速检测。目前已有真菌毒素、农药残留、兽药残留等系列相关检测产品供应市场，FAO已向许多国家推荐此项方法，有人称免疫分析法是21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析方法之一。
王权等采用无色孔雀石绿单克隆抗体建立了水产品中孔雀石绿残留的间接竞争ELISA检测方法，无须将提取物中的无色孔雀石绿氧化为孔雀石绿再检测，简化了检测方法。结果表明，标准曲线呈线性相关，相关系数为0.9823，最适检测范围1~256ng/mL，检测限为1.29ng/mL，批内和批间变异系数分别为4.307%和4.566%，鳗肉样的平均添加回收率为90%~110%。采用ELISA试剂盒检测水产品中孔雀石绿的特点是：检测速度快，2~3h就可检测一批样品；灵敏度高，在鱼、虾中检测灵敏度可达到0.01μg/kg。该方法特别适合大批量样品的筛选。虽然ELISA法的抗原和抗体结合有较强的选择性，但水产品的种类繁多、基质复杂，检测结果易出现假阳性，因此用该方法检出的阳性样品还需用HPLC法或LC-MS法进行定量和确证。
有报道分子印迹技术用于孔雀石绿残留检测。分子印迹技术是指制备对特定分子具有特异识别选择性的聚合物的过程，它可以被形象地描述成制造识别“分子钥匙”的人工“锁”的技术。该技术制备的印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长等特点，已被应用于色谱分离、固相提取、分子印迹聚合物模拟抗体的药物分析、生物传感器、免疫分析等领域，并显示出广泛的应用前景。黄敏等采用分子印迹技术，以孔雀石绿为印迹分子、丙烯酰胺为功能单体、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂、吐温-80为乳化剂，在60℃水溶液下合成了孔雀石绿分子印迹聚合物，并研究了其分子吸附性能，为复杂样品中孔雀石绿的选择性富集及快速检测提供了一定的物质基础。
总体来说，采用LC-MS测定水产品中孔雀石绿残留量是目前主流的检测方式，其灵敏度可达0.5μg/kg，符合相关法规的要求。但对于低浓度水平的复杂基质，不同检测手段所得到的定性结果差异较大，单四极杆和离子阱质谱测定结果较难确证，而串联四极杆和ToF-MS的检测结果较可靠。但采用HPLC和LC-MS检测孔雀石绿残留，过程复杂，检测周期长，且检测过程会产生有机废液污染环境。因此，应加快研究开发ELISA法、ICT等快速检测方法，并建立相应的标准。对大批量的被检样品，首先采用免疫分析法进行初筛，对阳性样品再用HPLC法或LC-MS法进行定性和定量，避免二次污染。
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