本研究的目的是确定，EO（精油）是如何干扰南美白对虾中致病性弧菌的QS（群体感应系统）。
对虾养殖业的增长速度虽然显着提高，但仍不断受到由病毒和细菌引起的病原体的攻击。最近，新出现的弧菌毒株毒性很强，可能导致对虾发病。大多数弧菌致病菌株对常见的抗生素表现出抗性，使其难以在水产养殖生产系统中控制。在很大程度上，耐药菌株的出现是由于抗生素的滥用，因为养殖户常用抗生素来治疗弧菌引起的疾病。
一、材料和处理
1、评估细菌菌株、生长条件和精油
①本研究中使用的四种弧菌是哈维氏弧菌（菌株 E22）、坎氏弧菌（菌株LM2013）、副溶血弧菌（菌株 ATCC 27969）和创伤弧菌（菌株S2）。所有菌株均在Luria Bertani琼脂中培养。
②研究主要评估了五种精油 (EOs)，即：有机油( EOOv )、互叶白千层精油 (EOma)、柠檬香茅精油 (EOCc)、肉桂精油 (EOCv) 和百里香精油 (EOTv)，对于抗QS分析，以及EO被乳化的影响，先前的一些研究已确定用作乳化剂的物质的剂量不会影响评估的参数。另外，确定EO的最低抑菌浓度 (MIC) 和最低杀菌浓度 (MBC) 值，以确定亚致死剂量，仅影响生物发光、生物膜生长和生物发光的QS指标。
③每个微孔板上包括阳性对照（含有细菌但不含E）和阴性对照（含有EO但不含细菌），每种浓度的Eos和对照组各重复6次。
图1：影响弧菌生长的精油 (A) 哈维氏弧菌、(B) 坎氏弧菌、(C)创伤弧菌和 (D) 副溶血弧菌菌株。所有浓度均针对四种弧菌进行了测试。
2、EOs对生物发光和生物膜形成的影响
评价EO对哈维弧菌、坎氏弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌四种菌株的生物膜的影响。细菌生物膜生物量用紫水晶 (CV) 染色并定量测量。为每种弧菌菌株制备细菌悬浮液。进行包含不含EO的细菌悬浮液的对照，每个浓度重复六次。去除浮游生物细胞并仔细清洗产生的生物膜两次。然后洗涤板以去除多余的染料并在室温下干燥。
3、EO对流动性的影响
还评估了EO对四种弧菌移动性的影响。对另外的LBb进行高压灭菌。将培养基LB冷却至45±30°C后，将EOs分别添加到待评价的每个浓度中。将LB培养基倒入培养皿中，将板干燥15分钟，然后在板之间接种弧菌。
将板在26摄氏度下孵育 72 小时，并以mm为单位测量细菌迁移。将用EOs处理的细菌的运动与未处理的细菌的运动进行比较。
4、EO的体外和体内毒性
为了确定EO在体内的安全性，在商业孵化场提供的三种南美白对虾虾苗，即：Zoea 1 (Z-1)、Mysis 1 (糠虾，M-1) 和虾苗 (PL)。每个测试都是独立进行的。测试中使用的水在高压灭菌器中过滤和消毒。EO精油在8小时后应用到每个实验单元的总含水量中，对照组是未暴露于EO的虾苗。监测虾苗96小时。将数据转换为存活百分比，将100%视为未接受EO的虾苗的存活率。此外，获得的数据确定了每个阶段的致死剂量为 50% (LD50)。
5、EOs的体内抗病毒作用和EOs在南美白对虾养成池中的应用效果
在此阶段，使用健康的南美白对虾虾进行的试验验证了EO的抗菌功效。制备细菌接种物，作为对照，进行不含EO的坎氏弧菌培养。
每日饲喂量最初设定为虾平均体重的约3%，并根据饲料消耗量和观察到的生长速率每周调整。在收获时评估最终虾存活率 (%)、平均体重 (g)、产量 (kg/ha) 和饲料转化率 (FCR)。
二、研究成果
1、确定EO的亚致死剂量和生物发光抑制
与评估的四种弧菌菌株相比，EOs表现出不同的MIC和MB 值。EOOv和Eoma的MIC和MBC值最低，表明它们的抑制和杀菌活性强于其他的精油。
结果表明，在测试的最高浓度下，没有EO影响四种致病性弧菌的生长。只有EOOv和Eoma显着降低了哈维氏弧菌和坎氏弧菌的生物发光。
对于EOOv和Eoma，每个细菌系中的生物发光抑制百分比显示出明显的浓度依赖性。EOOv是抑制生物发光最有效的精油。
2、EOs影响生物膜形成和细菌迁移
EOCc、EOCv和EOTv不抑制所评估的四种致病性弧菌中的生物膜形成，因此，在运动性测定和体内测定中没有进一步考虑它们。
EOOv和 Eoma显着降低了四种弧菌的生物膜浓度依赖性。
EOOv是在每种情况下将四种病原菌的生物膜减少50%以上的最有效的精油。
与EO相比，抗生素土霉素对弧菌生物膜形成的抑制效果较差，尤其是在副溶血性弧菌中。四种致病性弧菌的流动性受EO浓度的影响。
图2：精油和土霉素对弧菌菌株的影响。
对于土霉素运动性测试，我们选择了创伤弧菌菌株，因为它能够迁移以覆盖整个培养皿96小时。在这项研究中，我们发现EO也会影响抗生素耐药性。由于EOs降低了创伤弧菌的运动性，因此在EOs存在下的土霉素环一直保持到96小时实验结束。在对照组中，无菌环境随时间减少。
图3：在抗生素土霉素存在的情况下，精油具有减少创伤弧菌蠕动的作用。
3、EOs的体外和体内毒性，以及EOs在南美白对虾养成池中的有益作用
EOs的体内毒性试验表明，虾苗越早，它们对EOs的敏感性就越大。在Zoea阶段，两种EO严重影响了大多数评估剂量的存活率。关于Mysis（糠虾）阶段，EOs仅在评估的最高剂量下对生存产生负面影响。
对于虾苗阶段 (PL)，EOOv仅在10.0 μgmL-1浓度下降低存活率，任何浓度下的EOMa不影响虾苗的存活率。
在有和没有EO的情况下，观察到南美白对虾的累积死亡率之间存在显着差异。对于对照组，在两种评估剂量下用EOOv处理的池塘中，累积存活率和产量均显着提高 。对于Eoma，仅在最高剂量 (5.0 mg kg-1) 下存活率和产量显着高于对照组。
三、研究结论
研究表明，EOOv和Eoma作为饲料在虾池中使用时，取得了令人鼓舞的结果；哈维氏弧菌和坎氏弧菌的生物发光抑制；防止四种弧菌中的生物膜形成；在养成池中获得更高的存活率和产量。因此，EOOv和Eoma可以抑制与虾养殖相关的四种致病弧菌中QS的过程。
体外试验的观察结果可以确定体内试验的活性成分剂量，其中EOOv和EOMa显着提高了用坎氏弧菌试验的虾的存活率。
EOs即使在抗生素土霉素存在下也能抑制弧菌运动的能力，结果表明应用EOs，增加抗生素的有效性。在这项研究中，EOOv在所评估的四种弧菌中抑制QS的过程最有效。
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