解螺旋公众号·陪伴你科研的第1916天
别光八卦了，快来跟酸菜学文章套路。
“贵圈真乱”这个梗，终于从娱乐圈，金融圈，刮到了我们医学圈。一夜之间好多吃瓜群众都在打听五篇SCI的医学博士到底是一个什么样的学术水平。对于连SCI什么概念都没搞清楚的圈外人来说，理解Nature Communications发一篇共一文章有多难会很抽象。
以我多年科研经验估测，只能说大致已达到修炼了半部九阴真经的梅超风之武艺水平。在医学博士在读阶段，能够有如此学术成果傍身，可算得上一等一的武林高手，职业生涯的潜力不可限量。
站的高，摔倒的时候群众才更喜欢看热闹。我们其实不排斥这种文章带名字的操作，只是不满这样的好事怎么就落不到自己头上。
在多年讲课生涯中，我提到过医生做科研的至上境界，那就是有人为爱帮你发文章，学员们听后莞尔一笑，真正能够运用的万中无一。昨日酸菜的朋友圈有不少女博士纷纷表达了艳羡之情，当然自己姿色够不够是没有充分评估的，而男同胞们则普遍沉默，不敢表露鄙夷，因为扪心自问确实没有送Nat. Comm.共一的实力。
我出于对这种能力的好奇，下载了全文看了一下。一看作者排名便知这其实是有职业选手参与的一篇合作文章，一作与通讯都是来自中国科学院上海药物研究所与复旦大学附属中山医院内分泌科，已然是圈内顶级实力。
其余还有湖北理工、上海交大、瑞金医院和密西根大学安娜堡分校，更有3项国自然傍身，可谓有钱有人。文章结构清晰，层次分明，在不差经费的前提下，其实你们也可以（我随便说说，不要信以为真）。
背景知识
泛素化是体内重要的蛋白质翻译后修饰，是调控蛋白质降解和维持细胞蛋白稳态的关键机制。USP全称叫ubiquitin specific protease，即泛素特异性蛋白酶，是最主要的去泛素化酶。
首先需要说明的是，文章研究的疾病是脂肪肝，不过这一套研究模式在其他疾病中也是通用的。换一种疾病无非换了细胞动物模型、表型评价方法，不影响研究策略设计。
该文主变量是USP14，组学高通量分析寻找USP14的底物，揭示出对脂肪肝中FASN蛋白稳定性的作用。USP是一个蛋白家族，一共有58个成员，既然USP14可以来一篇这样的文章，其他USP蛋白可以依葫芦画瓢复制吗？
思路再延伸一下，磷酸化，、乙酰化、糖基化、sumo化等其他蛋白修饰形式呢？可谓延绵不绝。
言归正文，数据8 figures（不包括补充材料），内容可分为四个部分。
图2-4是第一部分，从USP14筛选了潜在的底物靶分子。
图5是第二部分，验证USP14与FASN的结合作用。
图1，6，7是第三部分，过表达和沉默USP14一正一反表型验证。
最后，图8是第四部分，从USP14找上游转录因子，定位到LXR。
这是一篇有高通量筛选的三元变量，包含两组分子交互（蛋白-蛋白和蛋白-DNA）的套路文章。下面看一下数据：
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当我们想证明一个蛋白（USP14）与一种疾病（脂肪肝）的关系时，按照因果论证的原则，需要观察因素和疾病的相关性（图1），并且证明上调因素可导致疾病（Gain of function，图6）以及在下调因素可抑制疾病发展（Loss of function，图7）。图1，图6，图7是最基本的操作，一扫而过即可。
Fig. 1 Upregulation of USP14 in livers from obese mice.
一眼判断趋势：USP14表达与脂肪肝是正相关的。
Fig. 6 Overexpression of USP14 promotes hepatosteatosis.
从观察分组判断在比较过表达USP14的生物学效应，可促进脂肪肝发展。
Fig. 7 Knockdown of USP14 improves hepatosteatosis in db/dbmice.
沉默USP14可以增强脂肪肝？什么鬼！从结果看是对的，沉默USP14可减轻脂肪肝，与图6结果呼应。但是improve这个词却用错了方向，包括Results部分的描述也是错的。
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USP14是一个泛素化调控相关的蛋白，泛素化可影响靶蛋白的稳定性。这类蛋白一种自然而然的机制模式就是去找新的底物，底物是一个与USP14存在结合的蛋白，由此揭示作用机制。
这篇文章采取了性价比很高的筛选策略，在Hela细胞中过表达和沉默USP14，用细胞样品进行高通量筛选。因为疾病脂肪肝没有现成的细胞模型，所以机制在肿瘤细胞Hela中操作，实验难度很低，费用也便宜。
这部分工作有一种比较简单粗暴的模式，找一家做蛋白组学服务的公司，把细胞样品制备好，丢给他们检测，只要你提供明确需求，结果都会分析好。
Fig. 2 Quantitative proteomic profiling for USP14 regulated proteins and interaction components.
USP14沉默的细胞样品，利用SILAC标记的定量蛋白质组及泛素化修饰组学技术，从定量蛋白质组学鉴定到108个下调蛋白和50个上调蛋白，从泛素化修饰组学鉴定到392个位点发生显著的泛素化修饰上调。
背景知识
SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture, SILAC)，其实验原理是在细胞培养基中加入轻、中或重型稳定同位素标记的必需氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，通过细胞的正常代谢，使新合成的蛋白带上稳定同位素标签。等量混合各类型蛋白质,酶解后进行质谱分析。通过比较一级质谱图中同位素峰型的面积大小进行相对定量，同时二级谱图对肽段进行序列测定从而进行蛋白鉴定。
Fig. 3 Functional annotation of altered proteome and ubiquitinome in response to USP14 KD.
延续图2的筛选结果，再做一个通路聚类分析，一次高通量实验输出两个figures。
Fig. 4 Purification of USP14 interacting proteins and identification of potential USP14 substrates.
第二个筛选实验，做的是免疫共沉淀 质谱鉴定，寻找USP14的结合蛋白。将得到的USP14互作蛋白质组与USP14敲除后表达下调的蛋白和泛素化修饰上调的蛋白进行两两比较，由此锁定了FASN（脂肪酸合成酶）。
在筛选获得的诸多交互作用分子中，只需要找到一个跟疾病明确相关，并且能够co-IP验证结合关系的即可入选，选择不是唯一，走通一条路即可成文。
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文章能够过10分，进入到分子交互作用的研究是可预期的内容。通过图4筛选挖掘出的USP14-FASN组合，需要进一步做实验验证，由此产生了图5的结果。
这部分结果依据分子交互论证的数据规范，还需要增加另外一个经典实验pull-dwon的佐证，并且针对交互作用的位点，也可以提供后续的研究。能够深入的机制细节止步于结合验证，忽视位点解析，是该文章分数难以再提高的一个明显瓶颈。
Fig. 5 Identification of FASN as a direct target of USP14.
用蛋白-蛋白交互作用最经典的co-IP实验来验证FASN与USP14存在结合。
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因为没有做两个蛋白结合作用的位点验证，为了给文章增加档次，引入新的变量，下游机制探讨完了再加入上游机制就是很常规的选择。上游机制里面最经典的就是找转录因子，从USP14的启动子来预测转录因子，并且用荧光素酶报告基因实验（Luciferase）和染色质免疫共沉淀（ChIP）双重验证，是标准套路。
Fig. 8 Regulation of USP14 expression by LXR.
转录因子LXR结合USP14启动子的交互作用验证。
总结：USP14并不是特别新颖的分子，其功能聚焦于泛素化对下游蛋白的调控也并不抓人眼球。但是文章通过两组交互作用的论证，明显的建立了学术门槛。要复制这一套玩法，核心在于蛋白-蛋白交互作用的co-IP，Pulldown实验平台，以及转录因子（蛋白-DNA交互作用）的ChIP、LuciferaseAssay实验平台，这几项技术都能搞定，借鉴此文思路没有任何障碍。
高通量组学输出很多的候选分子并不是文章难点，真正的难度在于只有验证成功的分子才能构成完整的故事，从筛选到验证可能一次成功，也可能需要重复多次，其中客观风险不可小觑。
在有生之年，做不了被人疼爱的宝宝，坐享文章成果，就只能期盼自己修成武艺，做一个能够疼爱
宝宝的人。诸君共勉~
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