大田作物生产是维持人类生存的重要物质基础，在植物学上可以分为单子叶和双子叶作物两大类，单子叶作物主要包括水稻、小麦和玉米等，双子叶主要包括大豆、油菜、棉花及番茄、黄瓜等作物。无论是对于单子叶作物还是双子叶作物，纯系创制均是其育种过程的关键环节。单倍体育种技术可加速纯系选育进程。对于玉米杂交育种来说，选育自交系是其核心环节，常规育种获得自交系需要8代以上，而DH育种（Doubled Haploid Breeding，国内习惯称为单倍体育种）只需要2代，可大大缩短育种年限，因而具有重要意义。单倍体育种技术，转基因技术和分子标记辅助育种技术是现代育种技术体系的三大核心技术。常识：自交系：在人工控制自花授粉情况下，经若干代，不断淘汰不良的穗行，选择农艺性状较好的单株进行自交，从而获得农艺性状较整齐一致、遗传基础较单纯的系，称为自交系。优良自交系间杂交所产生的生活力强、产量高的杂种后代，称为自交系间杂交种。其农艺性状优于品种或品种间杂交种。一般增产20～30%。目前在玉米上应用较多，水稻也有应用。双单倍体（Doubled Haploid）育种：简称DH育种，是利用诱导系诱导（或花药离体培养等手段诱导）产生单倍体植株，再通过染色体组加倍（自然加倍或药剂处理）使植物恢复正常染色体数的育种方法。DH育种能够在较短时间（2代）内便可以选育出DH纯系，大大缩短育种年限，是加速种质材料纯化、缩短育种年限的有效途径，是现代生物技术育种的主要支柱技术之一。分子标记辅助育种：分子标记辅助育种是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。可作为鉴别亲本亲缘关系，回交育种中数量性状和隐性性状的转移、杂种后代的选择、杂种优势的预测及品种纯度鉴定等各个育种环节的辅助手段。
单倍体（Haploid）指只具有配子染色体数目的细胞或个体。目前玉米单倍体育种普遍采用孤雌生殖诱导系诱导产生单倍体。单倍体植株一般比较弱小，且表现高度不育，只有加倍成2倍体才能恢复育性从而获得种子，加倍后形成的系称为DH系，DH系表现一致，可直接用于育种。单倍体育种技术是一项系统化、规模化与工程化的技术，涉及很多技术环节。单倍体的产生是单倍体技术中的核心环节，体外单倍体诱导方法包括花药培养、小孢子胚胎发生等，但成本高，且劳动强度大。在体内的技术包括种间杂交、花粉的强烈照射和孤雌生殖，但仅限于特定的作物品种。以种子为基础的体内单倍体诱导方法具有劳动强度低，成本相对较低的特点。紧接着，单倍体再通过秋水仙素加倍获得纯系，但秋水仙碱的毒性较大且加倍时间不好控制、加倍效率也不敢保证。
近年来，以生物诱导为基础的单倍体育种技术已逐步成为玉米育种的关键性技术。自1959年美国遗传学家E. H. Coe, Jr报道的Stock6作为父本诱导系可以诱导母本单倍体以来（诱导率仅为1-2%），但由于Stock6的一些缺点，诸如诱导率低，散粉性不好，自交结实性较差、保存种子困难；过去几十年，由Stock6衍生的一系列诱导系已成为DH育种的最有效的方法，虽然也有一些关于诱导率定位研究的报道，但控制诱导率的基因仍不清楚。
2017年，首次克隆了一个控制玉米单倍体诱导基因MTL/PLA1直到2017年1月23日，Nature杂志上发表来自先正达公司Timothy Kelliher等题为“MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction”研究论文。该文在玉米中第一次克隆了一个控制玉米单倍体诱导基因（基因命名为MTL，特异性在玉米精细胞中表达的磷脂酶），研究表明诱导系与玉米非诱导系B73相比，诱导系中的诱导基因第四外显子处有4bp插入（CGAG），导致了20个氨基酸的移码突变，导致诱导系具有诱导单倍体的作用。同时发现该基因具有高度保守性。
花粉特异性磷脂酶基因突变诱导的单倍体玉米（来源：先正达Nature）与此同时，2017年2月4日，中国科学家（中国农大的陈绍江教授、金危危教授及华中农大的严建兵教授团队）联合在Molecular Plant上同样也报道了该诱导基因（基因命名为ZMPLA1）。中国科学家发现该4bp插入只存在于玉米诱导系中，在玉米祖先（大刍草）及玉米非诱导系中均检测不到；两个研究不同的是对基因功能的验证，先正达公司使用的是互补实验及TALEN基因编辑技术；而中国科学家使用的是CRISPER/Cas9基因编辑技术，随后用T1代转基因材料与国内知名玉米杂交种郑单956和京科968杂交来测验T1代转基因材料的诱导率。
图. ZMPLA1基因的4bp的插入突变导致诱导系诱导单倍体（Molecular Plant,2017）鉴于该基因在作物中的保守性，因此也可在其他作物中通过修饰该基因实现DH育种。其它作物，如水稻中，还没有利用单倍体诱导来进行育种的报道。该基因的克隆有望让更多的作物进行单倍体育种，从而加快育种进程。
2019年，首个非Stock6来源的玉米单倍体诱导另一个关键诱导基因ZmDMP被克隆两年后，2019年，玉米单倍体育种技术研究中再次迎来了新突破。中国农大的陈绍江教授团队历经10余年不懈努力，在国际上率先克隆了首个非Stock6来源的玉米单倍体诱导另一个关键基因ZmDMP，这是该团队继克隆关键诱导基因ZmPLA1后取得的又一重大进展，这一关键基因的克隆为理解单倍体高频诱导的成因奠定了坚实的理论基础。
该课题组利用其选育的两个诱导率不同的诱导系CAUHOI和CAU5组配的群体进行图位克隆。先后从2万多个F2单株中筛选出37个交换单株，以基因分型子代测验的方法，将qhir8的候选基因区间缩小至318 bp，锁定了编码DUF679结构域膜蛋白（DUF679 domain membrane protein）的基因ZmDMP及其功能位点。该基因编码205个氨基酸，研究团队利用基因编辑等方法验证了该基因就是单倍体诱导的关键贡献基因。研究结果表明，在ZmPLA1突变的基础上，ZmDMP起始密码子下游的第131bp上T到C的单碱基替换导致氨基酸的错义突变，进而将单倍体诱导率提高2~3倍。将ZmDMP完全敲除则可进一步将单倍体诱导率提高5~6倍，呈现出显著的倍增效应。非常值得关注的是，该研究还发现了ZmDMP基因敲除后具有独立的诱导单倍体能力，这是首次在非stock6材料上发现独立诱导现象。通过ZmDMP的表达模式和亚细胞定位分析发现，该基因与ZmPLA1具有一定的相似性，均在成熟的花粉中表达和定位在细胞膜上。表明ZmDMP与ZmPLA1有可能在单倍体诱导的过程中参与相同的通路。同时，通过基因序列比较分析，发现该基因在大部分双子叶植物中具有较高保守性，因此在功能上可能具有保守性。
利用上述发现的控制玉米单倍体诱导基因MTL/ZMPLA1和ZmDMP在各物种的保守性，在单子叶植物，如水稻、小麦中和双子叶植物，如拟南芥中也实现了高效率的单倍体诱导作用。：
水稻中单倍体诱导基因OsMATL2018年7月10日，来自先正达的研究团队在Nature Plants发表了一篇题为“OsMATL mutation induces haploid seed formation in indica rice”的论文。该研究发现水稻中的玉米MTL同源基因OsMATL突变后可以诱导单倍体种子的形成。该研究利用CRISPR-Cas9技术突变OsMATL基因。结果发现，OsMATL突变后平均单倍体诱导率（haploid induction rate，HIR）为6%左右，授粉后种子结实率为20%，与玉米中MTL突变后的结果基本一致。据悉，先正达公司在2016年11月18日已就本研究相关的基因和技术提交了专利申请。
玉米单倍体诱导系统拓展至多倍体作物小麦2019年7月25日，Plant Biotechnology Journal在线发表了中国农业大学陈绍江教授团队的研究论文“Extension of the in vivo haploid induction system from diploid maize to hexaploid wheat”。该团队在克隆玉米单倍体关键诱导基因ZmPLA1的基础上，以异源六倍体小麦为模式开展了单倍体诱导能力验证研究。单倍体诱导基因在小麦中存在3个同源基因，分别位于A、B和D基因组上。利用CRISPR对第一外显子进行编辑，成功获得了小麦A、D基因组的磷脂酶基因TaPLA的突变体。实验数据表明，该突变体在自交或与中国春等母本材料杂交后代中可诱导产生约5%-15%的单倍体，其频率较玉米ZmPLA1单基因突变体高。同时，小麦突变体在自交和杂交过程中还伴随大量的败育籽粒和一定频率的非整倍体籽粒。进一步对TaPLAs进行亚细胞定位分析发现其编码的蛋白均定位于细胞膜上，且TaPLAs突变后对花粉粒发育并没有影响。这与玉米中的单倍体诱导基因ZmPLA1结果类似，表明单倍体产生在不同倍性作物中可能具有相似的机制。该研究在实践上不仅可为在小麦等多倍体作物上建立新型单倍体育种系统提供重要参考，而且还可能进一步与基因编辑和染色体工程等技术结合，开辟快速定向改良新途径。至此，以诱导基因为基础的母本单倍体诱导系统在三大粮食作物上均已获得验证，未来有望成为主要农作物纯系创制与性状快速改良的共性关键技术。单子叶植物到双子叶植物的单倍体诱导技术突破双子叶主要包括大豆、油菜、棉花及番茄、黄瓜等作物。无论是对于单子叶作物还是双子叶作物，纯系创制均是其育种过程的关键环节。2019年5月15日，陈绍江教授团队在Nature Plants期刊发表了以“A DMP-triggered in vivo maternal haploid induction system in the dicotyledonous Arabidopsis” 为题研究论文。对拟南芥中的ZmDMP同源基因进行敲除，成功获得了拟南芥的单倍体，为建立双子叶作物单倍体育种技术体系奠定了基础。陈绍江教授团队在玉米单倍体育种技术的拓展应用上再次取得突破性进展。研究团队通过对基因序列比对分析，发现玉米单倍体诱导基因ZmDMP在双子叶植物中的保守性较高。为验证其在双子叶植物上的功能，研究团队对拟南芥中的ZmDMP同源基因进行敲除，成功获得了拟南芥的单倍体。该研究首次将玉米孤雌生殖单倍体的诱导方法拓展至双子叶植物拟南芥中，并建立了基于荧光的拟南芥单倍体籽粒鉴别方法，为建立双子叶作物单倍体育种技术体系奠定了基础。
陈绍江教授团队荣获2019年国家技术发明奖一等奖
国家技术发明奖一等奖
提名项目：玉米单倍体高效育种技术体系创建及应用
提名单位：教育部
第一完成人：陈绍江 教授，中国农业大学
单倍体育种技术是玉米育种的革命性技术。该项目研究团队历经长期系统研究，在单倍体育种的基础理论及关键技术领域均取得了原创性的重要突破，解决了玉米育种选系周期长这一共性核心技术瓶颈，大大加快了育种进程。项目的主要发明创新点有：精细定位并克隆了单倍体诱导的关键基因；建立了诱导系的分子育种技术，首创高油型诱导系，育成系列高频诱导系；提出了油分鉴别单倍体新的技术原理并成功研发出自动化单倍体鉴别筛选设备；创建了单倍体高效加倍技术。通过对上述关键技术的集成，构建了玉米单倍体高效育种技术体系，形成新的育种模式，利用该技术创制新品种已经大面积推广。 该项目通过建立全国玉米单倍体育种技术协作组等形式，有力地促进了该技术在国内科研单位和种子企业的广泛应用，推动了我国玉米育种技术的转型与升级。项目成果的原创性强，对国内外玉米单倍体育种理论和技术发展均起到了重要的引领作用。该成果将技术发明与应用基础研究和育种实践紧密结合，创建了单倍体育种的高效技术体系，具有重大的科学意义和应用价值。
项目简介
近十年来，着丝粒组蛋白CENH3也成为单倍体诱导的研究热点。而且所有真核生物都表达多种H3变体，通过修饰着丝粒特异性组蛋白H3变体CENH3来诱导单倍体已经在拟南芥中被证明。突变CENH3基因并创造非转基因单倍体诱导系2020年2月24日，Plant Biotechnology Journal 杂志在线发表了美国加州大学戴维斯分校研究团队题为 "A variety of changes, including CRISPR/Cas9 mediated deletions, in CENH3 lead to haploid induction on outcrossing " 的研究论文。
在该研究中，作者在拟南芥中鉴定了另外31个CENH3，它们在植物中都是高度保守，并有能力执行CENH3参与的有丝分裂和减数分裂活动。EMS诱变系的氨基酸突变形式可以通过野生型授粉后互补内源cenh3突变基因型并诱导单倍体后代的产生。同时研究者还测试了通过两轮EMS诱变所产生的双氨基酸位点突变的效果。最后研究者意外发现利用CRISPR/Cas9技术诱导保守的CENH3组蛋白折叠机构域中αN螺旋的移码突变，能够获得优良的单倍体诱导系，并且在用野生型花粉授粉时生长和发育均表现正常。该研究结果展示出了EMS和CRISPR/Cas9突变CENH3基因并创造非转基因单倍体诱导系的前景。这些发现为作物育种者培育单倍体诱导剂提供了更多的选择。
CRISPR/Cas9介导的CENH3突变体的产生RNAi消减CENH3基因揭示诱发假雄配子的剂量效应2020年6月17日，山东农业大学作物生物学国家重点实验室曾范昌课题组，在iScience在线发表了题为“Haploid bio-induction in plant through mock sexual reproduction”的最新研究进展。该研究针对消减染色体的经典着丝粒组蛋白基因CenH3，在筛选系列相关化学抑制剂及体外诱导效应的基础上，结合基因干涉操作技术，从体内和体外鉴定了植物两性花有性生殖过程中伴随的诱发假雄配子的剂量效应，并提出并验证了假受精介导的虚拟有性生殖，诱发孤雌单性生殖和种子单倍体形成这一科学假设和全新理论。
实例一：2019年3月，先正达的研发团队（Timothy Kelliher 和Qiudeng Que共同通讯作者）利用能诱导产生单倍体株系的玉米花粉作为基因编辑的载体来通过授粉给有重要商业价值的品系，对商业化品种进行直接的基因组修饰，从而达到快速精准地实现玉米改良的目的。这是一个非常精妙的构思和科研创新，因为花粉中携带CRISPR装置的雄性基因组在受精后不久就会消失，新产生的植株含有部分母本的染色体，使之能快速创制稳定的育种所需要的变异材料（详见下图）。这是一种加快育种进程的新策略。有专家评论说：“通过结合两种技术：单倍体诱导和基因组编辑，它具有想象力。”
利用HI-Edit策略获得理想DH系的流程图由于来自诱导产生单倍体株系的父本花粉中含有基因编辑的复合体，在受精过程中将消失掉，产生的后代中并没有外源的基因，和转基因技术含有外源插入的基因不一样，在美国可以规避复杂的法规审批需求。实例二：2020年7月中国农业科学院谢传晓研究员发表论文，利用基因编辑技术一步创制雄性不育系和保持系，为作物杂交技术提供了高效的培育方案。在这项研究中，利用CRISPR/Cas9的新系统简化了杂交育种的流程，仅需一步就可以创制不育系和保持系，并同时解决了不育基因导入和不育株筛选的问题。如图所示，谢晓传研究团队构建了两个载体：一个用来构建创制雄性不育系，用来创制保持系。MS26ΔE5-Editor 载体具有基因编辑活性，用于创制雄性不育系。通过剪掉玉米中育性基因MS26的一小段，使MS26基因失去功能，让玉米雄性不育。而MGM载体则用于创制保持系，包括三个基因，一个用来恢复MS26的功能，另一个是能导致花粉失去活性的酶，还有一个会让玉米粒发出红色荧光。最终，经过处理的玉米胚胎将携带两个被剪切的MS26和一个MGM拷贝。
在杂交体系中，使用不育系作为母本，就可以与其他父本优势种杂交获得杂交种。而使用保持系自交时，由于MGM上携带的花粉淀粉酶基因会造成花粉败育，因此只有不携带MGM的花粉可以作为雄配子，雌配子则一半携带MGM，一半不携带MGM，最终产生一半不育系和一半保持系。由于MGM上的荧光基因，保持系的玉米籽粒会发出荧光。实验证明，不管是人工和机器方法都可以有效的区分不育系和保持系籽粒的荧光，以便筛选。在这个系统中，不育系植株不携带外源性的MGM基因，因此只要是与非转基因品种杂交产生的后代，就不含外源基因。目前，单倍体育种技术已经在国内外多家企业应用实现转型，在国家和省级农科大学及研究院所广泛使用，跨国企业规模化应用。
综上， 单倍体育种技术具有操作相对简便、育种周期短（只需要2代）、效率高等优点，在育种中的应用前景十分广阔。单倍体育种技术已经成为代育种技术体系的三大核心技术之一。随着其关键调控基因的进一步挖掘和基因编辑技术的深度耦合并形成技术体系，实行工厂化育种指日可待。未来，单倍体育种必将引领新一轮的育种技术革命！！！
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