【实验目的】了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。
【实验原理】菌种是极其重要和珍贵的生物资源。获得性状稳定的菌种是微生物学工作最基本的要求，否则生产或科研都无法正常进行。微生物具有容易变异的特性，因此，在菌种保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但基本上都是根据这三个因素而设计的。
斜面传代保藏法：是实验室最常用的一种保藏方法，通常将斜面培养基上生长良好的培养物直接放到4℃冰箱（图8-1a）中保藏，利用低温抑制微生物的生长，一般保藏期为1～6个月。
液体石蜡油封藏法：是在斜面培养物或穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面隔绝空气，以减弱微生物的代谢作用，在4℃冰箱中可保藏1～2年。
甘油保藏法：是利用甘油作为保护剂的一种低温保藏方法。一般来说，在—196～4℃低温范围内，温度越低，保藏效果越好。但菌种在冷冻和冻融过程中细胞会受到损伤，而利用甘油或适度的二甲基亚砜等作为保护剂少量渗入细胞，可缓解在冷冻过程中由于强烈脱水及胞内形成冰晶体而引起的对菌种细胞的破坏作用。将甘油保藏菌种放在—20℃或—70℃低温冰箱（图8-1b）中，一般可保存3～5年。
砂土管保藏法：利用了干燥、缺氧、缺乏营养、低温等综合因素抑制微生物的生长繁殖，从而延长保藏时间。无菌操作将孢子悬液滴入无菌的砂土管中，使孢子吸附在砂子上，再将砂土管置于真空干燥器中，抽真空，除去砂土中的水分，于4℃冰箱中保存。此法仅适用于保藏产生芽孢或孢子的微生物，保藏期可达数年至十几年之久。
真空冷冻干燥保藏法：先使微生物样品在极低温度（—70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥），最后达到干燥。此法集中了菌种保藏中所需的低温、缺氧、干燥和添加保护剂等多种有利条件，使微生物的代谢处于相对静止状态。除不生孢子只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用外，其他各类微生物（如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、部分丝状真菌等）都可用冷冻干燥法保存，是目前最有效的菌种保藏方法之一。图8-1c和图8-1d是常见的冷冻干燥机。
液氮保藏法：将保存的菌种用保护剂制成菌悬液密封于安瓿管内，经控制速度冻结后，贮藏在—196～—150℃的液态氮超低温冰箱中。对于用冷冻真空干燥法保存不易成功的微生物（如支原体、衣原体、小型藻类）或原生动物，都可用此法长期保藏，它是当前保藏菌种最理想的方法。图8-1e为常见的液氮罐。
图8-1 菌种保藏设备a．4℃普通冰箱；b．—70℃低温冰箱；c．台式多歧管压盖型冷冻干燥机；d．离心式冷冻干燥仪；e．储存式液氮罐
【实验器材】
1．菌种细菌、酵母菌、放线菌和霉菌菌种。
2．培养基高氏1号琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基。
3．试剂化学纯的液体石蜡、脱脂牛乳、甘油、二甲基亚砜、五氧化二磷、河砂、瘦黄土或瘦红土、冰块、食盐、干冰、95％酒精、10％盐酸、无水氯化钙等。吸管，酒精灯，滴管，培养皿，安瓿管（圆底硼硅玻璃制品或螺旋口的塑料管），60目、80目、100目筛子，干燥器。
4．仪器和用具真空冷冻干燥仪、真空泵、喷灯、生化培养箱、冰箱、低温冰箱（—70℃）、液氮罐、控速冻结器、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。
【实验步骤】
1．斜面传代保藏法
（1）接种：将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上。
（2）培养：细菌置于37℃恒温箱中培养18～24h；酵母菌置于28～30℃恒温箱中培养36～60h；放线菌和丝状真菌置于28℃下培养4～7d。
（3）保藏：棉塞部分用牛皮纸包扎好或用熔化的固体石蜡封棉塞后，移至2～4℃的冰箱中保藏。注意：保藏时间依微生物的种类不同而有不同：霉菌、放线菌及有芽孢的细菌每保存2～4个月移种1次；酵母菌2个月移种1次，细菌最好每月移种1次。
2．液体石蜡保藏法
（1）准备液体石蜡：将液体石蜡分装于三角烧瓶内，于121℃灭菌30min，连续灭菌2次，然后放在40℃恒温箱中2周（或置于105～110℃烘箱中2h），使水汽蒸发，备用。
（2）制备菌种：将需要保藏的菌种在适宜的斜面培养基中培养，得到健壮的菌体或孢子。
（3）加石蜡：用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为宜，使菌种与空气隔绝。
（4）保藏：将试管直立放置于4℃冰箱中保藏。
3．甘油保藏法
（1）制备无菌甘油：用蒸馏水将甘油配成40％的浓度，121℃高压蒸汽灭菌20min后，备用。
（2）制备菌悬液：培养适龄斜面菌种，用生理盐水洗下菌苔细胞，制成一定浓度（108～109个/mL）菌悬液。用无菌移液管吸取1.5mL，置于带盖的无菌试管中（或无菌的EP管加0.5mL）。
（3）滴加甘油：加等量甘油混匀，制成含10％～20％甘油的菌悬液。
（4）保藏：将甘油管置于干冰或液氮箱中速冻，然后于—70℃超低温保藏。
3．砂土管保藏法
（1）处理砂土：将河砂用60目筛子过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目筛子过筛，去掉细砂。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用10％盐酸浸泡，如河砂中有机物较多，可用20％盐酸浸泡。24h后倒去盐酸，用水洗至中性，将砂子烘干或晒干。另取瘦红土用100目筛子过筛，水洗至中性，烘干。
（2）装砂土管：将砂与土按2∶1（m/m）的比例混合。把混匀的砂土分装入安瓿管或小试管中，高度为1cm左右。塞好棉塞，121℃、0.103MPa高压蒸汽灭菌30min。灭菌后挑少量砂土接种培养基经培养检查无菌后方可使用。
（3）制备孢子悬液：在培养好的斜面菌种中注入3～5mL无菌水，洗下孢子制成悬液。
（4）加孢子液：用无菌吸管吸取孢子悬液，均匀滴入砂土管中，每管0.2～0.5mL。也可直接挑取干孢子拌入砂土管中。
（5）干燥：将砂土管放置于干燥器内，用真空泵抽气3～4h。
（6）纯培养检查：从做好的砂土管中，按10％比例抽查。无菌条件下用接种环取出少量砂土粒，接种于适宜的固体培养基上，培养后观察其生长情况和有无杂菌生长。如出现杂菌，或菌落数很少，或根本不长，则需进一步抽样检查。（7）封管保藏：将纯培养检查合格的砂土管用火焰熔封管口。制好的砂土管存放于低温（4～15℃）干燥处，或将砂土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置于干燥器内保存。
5．真空冷冻干燥保藏法
（1）准备安瓿管：安瓿管宜采用中性玻璃制造，大小要求外径6～8mm，长约100mm，也可用1mL耐温变EP管（可用离心式真空冷冻干燥仪进行干燥）。安瓿管管口塞好棉花，121℃灭菌30min，备用。
（2）制备脱脂牛奶：用脱脂奶粉配成20％浓度的溶液，分装后于112℃灭菌30min，做无菌检查。
（3）准备菌种：在最适培养基中最适温度培养菌种，以便获得良好的培养物。能形成孢子的微生物宜保存孢子。
（4）制备菌悬液及分装：取脱脂牛奶2mL左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管或EP管中分装0.2mL。注意：滴加在管内底部，不要使菌液沾在管壁上。
（5）冷冻干燥：将分装好的安瓿管放于超低温冰箱中冷冻过夜，确保样品温度达到—70℃。启动冷冻干燥机制冷系统，当温度下降到—45℃时，将装有已冻结菌液的安瓿管迅速置于冷冻真空干燥机钟罩中，开动真空泵进行真空干燥。从钟罩上端看样品呈白色酥丸状，并从安瓿管内壁脱落，可认为已初步干燥了。注意：在真空干燥过程中，安瓿管内样品应保持冻结状态，以防止抽真空时样品产生泡沫而外溢。先关闭真空泵，再关制冷机，然后打开进气阀，使钟罩内真空度逐渐下降，直至与室内气压相等，再打开钟罩，取出安瓿管。注意：用EP管的在预冻后可直接放入离心式冷冻干燥仪中，开动真空泵，进行离心干燥。
（6）封管保藏：将上述安瓿管近颈部塞有棉花的下端处用喷灯火焰烧熔并拉成细颈，再将安瓿管装在该机的多歧管上，启动真空泵，室温抽真空达1.33Pa时，在安瓿管细颈处用火焰灼烧、熔封。封口以后，保存于4℃冰箱。EP管取出后用封口膜密封保藏。注意：熔封安瓿管时火焰大小要适中，封口处灼烧要均匀，若火焰过大，封口处易弯斜，冷却后易出现裂缝而造成漏气。
（7）恢复培养：如需要移接或再培养，先用75％乙醇消毒安瓿管外壁，然后将安瓿管上部在火焰上烧热，在烧热处滴几滴无菌水，使管壁产生裂缝，放置片刻，让空气从裂缝中慢慢进入管内，然后将裂口端敲断，这样可以防止空气因突然开口而冲入管内使菌粉飞扬。再将少量合适培养液加入安瓿管中，使干菌粉充分溶解。用无菌的长颈滴管吸取菌液至合适的培养基中，也可用无菌接种环挑取少许干菌粉至合适培养基中，置于最适温度下培养。
6．液氮保藏法
（1）准备安瓿管：采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，大小通常为75mm×10mm。将空安瓿管塞上棉花，于121℃灭菌15min。
（2）制备保护剂：配制20％甘油或10％二甲基亚砜（DMOS）水溶液，于121℃灭菌30min。
（3）分装菌液：将菌种用20％的无菌甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管内，每管0.5mL；霉菌菌丝体则可用0.5mm灭菌打孔器从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内。用火焰熔封，浸入水中检查是否密封。
（4）冻结：将已封口的安瓿管在控速冻结器内以每分钟下降1℃的慢速冻结至—30℃。注意：若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，从而降低成活率。
（5）保藏：将冻结至—30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。
（6）恢复培养：需要用保藏的菌种时，将安瓿管取出，立即将它们放入38～40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。注意：放在液相中保藏的安瓿管，管口务必熔封严密。否则，当安瓿管从液氮中取出时，因进入管中的液氮受外界较高温度的影响而急剧气化、膨胀，致使安瓿管爆炸。
【实验报告】
1．实验结果列表比较常用的简便菌种保藏法适合保藏的微生物类型及其保藏温度和时间。2．思考题
（1）对于经常使用的细菌菌种，短期内用哪一种方法保藏既好又简便？
（2）液氮超低温保藏法的原理是什么？为什么需用含保护剂的液体培养基制备菌悬液？保护剂的作用是什么？
（3）产孢子的微生物常用哪一种方法保藏？
（4）用什么方法检查安瓿管是否熔封严密？如管口未封严，将会产生什么不良后果？
（5）在冷冻干燥保藏中，为什么必须先将菌悬液预冻后才能进行真空干燥？（朱丽云）
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