在酵母杂交那些事儿（一）和（二）中，小远基本对各种类型的酵母杂交都做了介绍，当然也有没介绍到的，毕竟种类繁多，小远也就只能挑一挑为大家讲解，主要是想开拓大家对酵母杂交的了解，有些方法在植物领域的研究中可能比较少见，或者基本就没用过，但是也不妨碍大家对它进行了解，在介绍了这么多内容之后，今天小远终于可以实现诺言为大家讲一讲酵母杂交在文献中的应用实例啦，现在小编就来说说关于酵母双杂交操作流程?下面内容希望能帮助到你，我们来一起看看吧!
酵母双杂交操作流程
在酵母杂交那些事儿（一）和（二）中，小远基本对各种类型的酵母杂交都做了介绍，当然也有没介绍到的，毕竟种类繁多，小远也就只能挑一挑为大家讲解，主要是想开拓大家对酵母杂交的了解，有些方法在植物领域的研究中可能比较少见，或者基本就没用过，但是也不妨碍大家对它进行了解，在介绍了这么多内容之后，今天小远终于可以实现诺言为大家讲一讲酵母杂交在文献中的应用实例啦！
01 酵母双杂实验结果解读
咳咳，在为大家列举文献案例之前，小远想以酵母双杂为例，为大家讲讲酵母双杂的实验结果到底应该怎么看！之所以把这个专门拿出来写是因为小远一开始接触的时候被它困扰过，为了大家不再被同样的内容困扰，小远决定将自己理解的知识写出来，帮助需要被帮助的同学，让大家少一点困扰！
图1 利用酵母双杂实验验证SPX6与PHR2相互作用(Zhong et al., 2018)。
对于这个酵母双杂的结果，很多人应该都能看懂，但也不排除看不懂的同学，为了让不懂的同学也能看懂这个结果，小远决定接下来仍要好好讲一讲！因为小远的目标是不放弃任何一个有疑问的同学哦！
在给大家讲如何去看这个结果之前，先给大家讲一些背景知识，这些背景知识对于大家理解实验结果是很有必要的！所以一起来听一听吧！与大肠杆菌采用抗生素筛选的策略不同，酵母系统常采用营养标记作为报告基因。常用的报告基因有 His3，Ura3，Leu2 和 Ade2 等（具体信息可参见表1），对应的宿主菌则是相应标记的缺陷型细胞，必须要在含有该营养标记的培养基中才能生长。Gal4系统中的酵母菌种经过了基因改造后既不能产生Gal4，又不能合成组氨酸（His）、尿嘧啶（Ura）、亮氨酸（Leu）、腺嘌呤（Ade）等，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。只有当转入对应的质粒且相互作用的蛋白存在时，才能激活报告基因的表达，从而通过功能互补，酵母才能够在不含营养标记的培养基中生长，据此来验证两个蛋白是否存在相互作用。同样，也可以通过显色反应进一步确认是否有相互作用。
表1 酵母双杂实验中使用的报告基因。
我们先看图片最上面的“ ”和“-”，可以看到一共分三列，右边一列：SPX6-AD与PHR2-C-BD对应的位置都是“ ”号，它代表的意思是将这两个质粒共转酵母菌株，作为该实验的实验组；中间一列：BD与SPX6-AD对应的位置是“ ”号，表示将这两个质粒共转酵母菌株，作为该实验的对照组；左边一列：AD与PHR2-C-BD对应的位置是“ ”号，它表示将这两个质粒共转酵母菌株，同样也是该实验的对照组。其中AD是质粒pGADT7的简称，携带Leu基因，BD是质粒pGBKT7的简称，携带Trp基因。
SD/-Leu-Trp表示缺亮氨酸和色氨酸的培养基，也就是二缺板，可以看出三组实验都长出了酵母菌落，也就是对应的质粒都转入了酵母菌株，具体来说就是AD载体携带Leu基因，转入酵母菌株后可以合成亮氨酸，BD载体携带Trp基因，转入酵母菌株后可以合成色氨酸，两个质粒都转入酵母菌株，酵母菌株就可以在对应的二缺板上生长。
二缺板证明了对应的质粒是否转入酵母菌株之后，接下来的四缺板就是为了证明两个蛋白之间是否存在互作。
SD/-Leu-Trp-His-Ade表示缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养基，也就是四缺板，从图中可以看出在四缺板上只有实验组的酵母菌株能够生长，两个对照组的酵母菌株无法生长，这一结果就证明了SPX6与PHR2存在互作。其背后的原理是SPX6与PHR2存在互作就会使得AD与BD靠近重组成有功能的Gal4转录因子，Gal4激活下游的报告基因His和Ade的表达，酵母菌株就能合成组氨酸与腺嘌呤，加上AD和BD上携带的营养标记基因，其对应的酵母菌株就能在四缺板上生长，而对照组因为不存在互作，也就不能重组成有功能的Gal4转录因子，最终也就不能在四缺板上生长。
小远叨叨
1、在酵母双杂实验中，是需要检测BD载体上基因的自激活活性的，但是在发表的文章中一般会省略，放在补充材料中，这一点大家要清楚哦！具体的做法是将需要研究的基因A构建至BD载体上，即pGBKT7-A与AD空载体pGADT7共转酵母菌株，观察在三缺或四缺板上能否生长，若能生长，就证明基因A存在自激活活性，不能生长就说明基因A不存在自激活活性，只有在基因A不存在自激活活性的情况下才能进行后续的双杂实验。
2、注意区分蓝白班筛选中的X-Gal和X-α-Gal，它们并不是同一个东西哦！X-Gal是E.coliβ-半乳糖苷酶（LacZ）的反应底物，而X-α-Gal是酵母α-半乳糖甘酶（MEL1）的反应底物。
X-α-Gal检测酵母MEL1基因的激活。MEL1是Gal4酵母双杂交系统的一个报告基因，编码分泌α-半乳糖苷酶。该酶可水解无色的X-α-Gal底物并最终产生蓝色底物。表达α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培养基上显蓝色，即阳性的双杂交作用。X-α-Gal可在培养基上直接检测酵母双杂交相互作用，利用此底物可以省去双杂交体系中的β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays；
X-Gal用于检测LacZ基因合成的 β-半乳糖苷酶的活性。由于β-半乳糖苷酶不能分泌，需裂解酵母细胞后通过加入β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays才能进行显色，因此操作流程相对繁琐。
携带MEL1基因的酵母菌株包括：Y2HGold、Y190、AH109、Y187、PG69-2A。
在明白了实验结果怎么看之后（这里只介绍了酵母双杂的结果，主要是因为酵母双杂很经典，其它的方法基本也都是在它的基础上发展而来的，对于酵母杂交很多东西也都是相通的，因此，小远相信介绍了这个，其它的大家应该也都会了。另外不同的文章以及不同的作者对结果的展现形式有所不同，但只要懂了其中的原理，不管形式怎么变你都不会被难倒哦！），下面就跟着小远一起去看看具体的文献实例吧！
02 文献应用举例
2.1酵母单杂交
在“Crocus transcription factors CstMYB1 and CstMYB1R2 modulate apocarotenoid metabolism by regulating carotenogenic genes”一文中作者为了解析CstMYB1和CstMYB1R2的作用机制，通过酵母单杂交（Y1H）的方法检测出了它们与类胡萝卜素途径基因PSY和CCD2启动子的相互作用。
首先，作者扩增并克隆了PSY和CCD2的启动子，并进一步扩增了100bp PSY和170bp CCD2启动子的天然片段。这些片段分别含有一个和两个MYB结合区域。另外，作者也相应地生成了它们的突变体结构（PSY一个，CCD2两个）。分别用天然和突变的启动子片段制备诱饵菌株，并通过检测每个诱饵菌株的最小aureobasidin A（AbA）浓度，推断它们与CstMYB1和Cst-MYB1R2的相互作用。对于PSY启动子，只有CstMYB1R2表现出相互作用，当突变型PSY诱饵株（pPSY-mut）的PSY启动子区段的MYB结合位点发生突变时，这种相互作用就会消失，这一结果表明了CstMYB1R2-PSY相互作用的特异性（图2a）。同时，作者还观察到CstMYB1、CstMYB1R2共转化 CCD2天然片段诱饵（pCCD2wt）的酵母细胞可以在添加了AbA的选择性培养基上生长，这证实了CstMYB1和CstMYB1R2与CCD2启动子的相互作用。然而，只有一个MYB结合位点发生突变的CCD2菌株（pCCD2mut1）可以在含有200 ng mL-1 AbA的选择培养基上生长，而两个MYB结合位点都发生突变的CCD2菌株（pCCD2mut2）无法在选择培养基上生长（图2b）。因此，CstMYB1仅与CCD2启动子直接结合，而CstMYB1R2同时与PSY和CCD2启动子结合。
图2 酵母单杂交实验显示CstMYB1和CstMYB1R2与启动子（a） PSY及其突变形式（b） CCD2及其突变形式的结合。转化子在SD-Ura-Leu上生长，并添加200 ng的AbA(Bhat et al., 2021)。
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这里的结果形式与上面的举例的结果形式有差别，但背后的原理基本都差不多，都是将对应的质粒共转化至酵母菌株中，能在对应的培养基上生长就能证明质粒转进去了以及存在相互作用。所以大家以后遇到不同的结果形式不要慌，把握住核心原理什么难题都能迎刃而解哦！
2.2核体系酵母双杂交
虽然上面解读结果的时候已经给大家讲过核体系酵母双杂交的案例，但是也不妨碍小远再给大家列举一个例子，这个例子中作者做了阳性对照（BD-p53，AD-T）与阴性对照（BD-Lam，AD-T），这两组对照实验可以认为是酵母双杂实验中公认的阳性对照与阴性对照，与研究动物还是植物的基因并没有太大关系哦！
图3 利用酵母双杂交分析EjAP2-1和EjMYB1/2的蛋白相互作用(Zeng et al., 2015)。将EjAP2-1融合到pGBKT7（BD）和EjMYB1/2融合到pGADT7 （AD）的组合共转化酵母菌株。以BD-p53、AD-T为阳性对照，以BD-Lam、AD-T为阴性对照。在不含Leu、Trp、His和Ade，有或没有AbA的SD培养基（SD/-Leu-Trp- His-Ade和SD/-Leu-Trp-His-Ade AbA）上测定蛋白质的相互作用。
2.3膜体系酵母双杂交
在“Specificity of Plant Rhabdovirus Cell-to-Cell Movement”一文中，作者用到了分裂泛素膜酵母双杂交的实验方法验证了两个蛋白之间的互作，由于背景知识有点复杂（可能是接触的太少了），小远在这里就不给大家介绍那么多了，简单讲讲关于膜体系酵母双杂部分的实验结果，让大家清楚这类实验的思路应该是怎样的就好，至于根据结果得到了一个什么样的结论，大家有兴趣可以自己去看哦！
文中作者首先对SYNV和TYMaV的亚细胞定位做了一个分析，如下图所示：SYNV sc4-GFP和TYMaV P3-GFP主要定位在质膜中，另外，少部分的SYNV sc4-GFP也存在于细胞核中。
图4 SYNV sc4-GFP和TYMaV P3-GFP的亚细胞定位分析(Zhou et al., 2019)。
根据亚细胞定位的结果，作者选择以分裂泛素膜酵母双杂交的实验方法来验证SYNV和TYMaV两个蛋白分别与其它蛋白的N蛋白或P蛋白互作情况，具体结果如下：
将膜相关的SYNV sc4和TYMaV P3蛋白分别融合到泛素（Cub）和人工转录因子LexA-VP16的C端，而SYNV、TYMaV和RSMV的N蛋白分别以N端（X-NubG）或C端（NubG-X）融合到突变的泛素N端（NubG）。通过该实验，作者发现sc4特异地与SYNV的N蛋白相互作用，而与TYMaV和RSMV的N蛋白不存在相互作用（图5A）。同样，TYMaV P3只与同源的TYMaV 的N蛋白相互作用（图5B）。
与此同时，将SYNV、TYMaV和RSMV的P蛋白分别以N端（X-NubG）或C端（NubG-X）融合到NubG上。MYTH实验显示，SYNV sc4特异地与其同源P蛋白相互作用，而与非同源P蛋白不发生相互作用（图5C）。同样，也检测到同源的TYMaV P3-P互作，尽管TYMaV P3与RSMV P蛋白的互作比较弱（图5D）。
图5 用分裂泛素膜酵母双杂交（MYTH）分析杆状病毒MP-核衣壳核心蛋白相互作用(Zhou et al., 2019)。（A至D）诱饵包含与SYNV sc4 （A和C）或TYMaV P3 （B和D）融合的载体，猎物编码与NubG的N端（N-NubG）或C端（NubG-N）融合的SYNV、RSMV或TYMaV的N （A和B）和P （C和D）蛋白。酵母细胞与诱饵和猎物质粒共转化。转化子在缺亮氨酸和色氨酸的缺失培养基（SD-LW）上连续稀释10倍以确认两个质粒的存在。用缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤（SD-LWHA）培养基筛选阳性相互作用。
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通过这个例子我们可以发现，酵母双杂实验应该安排在亚细胞定位实验的后面，通过亚细胞定位的结果选择合适的酵母双杂方法，一般情况下，只要亚细胞定位不定位在细胞膜上，就可以选择核体系的酵母双杂进行后续实验，而定位在细胞膜上的蛋白就要选择膜酵母双杂交方法！
2.4 酵母三杂交（3个蛋白互作）
在“A negative feedback loop of TOR signaling balances growth and stress-response trade-offs in plants”一文中，作者先利用酵母双杂以及荧光素酶互补实验分别验证了FLZ8-SnRK1α1和FLZ8-RAPTOR1B互作，然后又利用BiFC实验分别验证了FLZ8-SnRK1α1和FLZ8-RAPTOR1B在内质网中互作。根据这些已有的结果，作者进行了猜测并进行了酵母三杂交实验。
FLZ8与SnRK1α1和RAPTOR1B在相似的细胞质定位上相互作用表明：FLZ8可能作为一种支架蛋白，介导SnRK1α1与RAPTOR1B的相互作用。为了验证这一假设，作者采用酵母三杂交（Y3H）实验，其中FLZ8与SnRK1α1和RAPTOR1B一起，在葡萄糖抑制和半乳糖诱导启动子（GAL1）的控制下表达。在添加半乳糖的条件下，FLZ8的表达强烈增强了SnRK1α1与RAPTOR1B的相互作用（图6B），而在添加葡萄糖条件下生长的细胞中没有这种相互作用（图6A）。
图6 在添加葡萄糖和半乳糖的条件下，Y3H法分析FLZ8存在时SnRK1a1和RAPTOR1B的相互作用(Jindal et al., 2022)。
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这里的酵母三杂交需要知道谁是起桥梁作用的，如果不清楚，恐怕也很难用这个方法进行验证，就像本例中，如果选错了起桥梁作用的蛋白，例如选成了SnRK1a1，如果SnRK1a1与RAPTOR1B不互作，那么用这种组合方式进行的酵母三杂可能就得不到我们想要的结果了！当然在本例中我们也看到了起桥梁作用的蛋白也不是随意选的，都是在一定的实验基础上才进行了选择哦！所以我们要明白在平时的实验中很多实验都是环环相扣的哦！
小结
文章到这里就结束了，在本文中进行举例的方法是在植物科研领域的文献中经常出现的，但小远在酵母杂交那些事儿（一）和（二）讲的方法不止这些，剩下没讲的基本都是没找到相关文献的，可能那些方法在动物领域应用的比较多，但在植物领域应用的就比较少，如果大家有看到相关的文献可以与小远一起讨论哦！另外，在查找文献的过程中也有好多方法是小远没讲到的，大家有兴趣可以自己去查文献，“酵母杂交那些事儿”到这里就完结了，感谢大家的关注哦！
References：
Bhat Z Y, Mohiuddin T, Kumar A, et al. Crocus transcription factors CstMYB1 and CstMYB1R2 modulate apocarotenoid metabolism by regulating carotenogenic genes[J]. Plant Molecular Biology, 2021, 107(1): 49-62.
Jindal S, Sharma M, Awasthi P, et al. A negative feedback loop of TOR signaling balances growth and stress-response trade-offs in plants[J]. Cell Reports, 2022, 39(1): 110631.
Zeng J, Li X, Xu Q, et al. EjAP2‐1, an AP2/ERF gene, is a novel regulator of fruit lignification induced by chilling injury, via interaction with EjMYB transcription factors[J]. Plant Biotechnology Journal, 2015, 13(9): 1325-1334.
Zhong Y, Wang Y, Guo J, et al. Rice SPX6 negatively regulates the phosphate starvation response through suppression of the transcription factor PHR2[J]. New Phytologist, 2018, 219(1): 135-148.
Zhou X, Lin W, Sun K, et al. Specificity of plant rhabdovirus cell-to-cell movement[J]. Journal of Virology, 2019, 93(15): e00296-19.
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