已有的文献表明9号染色体短臂p21区域（9p21）是人类动脉粥样硬化疾病相关的重要基因座，非编码RNA ANRIL(CDKN2B-AS1)就位于该区域，该基因也可以形成环状RNA。线性的ANRIL（linANRIL）表达增高与动脉粥样硬化有关。在linANRIL中存在Alu元件，且该元件在灵长类动物中相对保守，暗示可能是一种功能获得性基因进化结果。基于这一系列的研究背景，作者提出重要的科学问题：ANRIL基因的环状RNA是否与动脉粥样硬化疾病有关？本文通过蛋白质组学筛选，生物信息学分析和功能验证最终发现circANRIL能够调控核糖体RNA的成熟过程，影响核糖体生成和核仁压力，最终影响动脉粥样硬化疾病进程。
图1 ANRIL基因外显子对应的环状RNA分子（来自(Holdt et al., 2016)）
进一步在不同组织和细胞系中鉴定circANRIL的表达量，表明外显子5,6,7所形成的环状RNA是含量最丰富的形式，作者将外显子5,6,7环化形成的环状RNA定义为circANRIL。
图2 ANRIL基因对应的不同环状RNA在不同组织和细胞中表达分析（来自(Holdt et al., 2016)）
进一步分析circANRIL表达量，表明circANRIL表达量大约是linANRIL RNA的表达量的9.7倍，比著名的环状RNA CDR1as及circHPRT1的表达量还要高。这说明circANRIL是表达丰度相对较高的非编码RNA分子。
图3 circANRIL表达量定量分析 （来自(Holdt et al., 2016)）
作者也进行了荧光原位杂交分析（FISH），表明circANRIL在动脉粥样硬化血管组织中存在高表达。
图4 荧光原位杂交分析circANRIL组织表达特异性 （来自(Holdt et al., 2016)）
由于9p21染色质区是动脉粥样硬化对应的基因座区域，circANRIL是否直接参与了动脉粥样硬化疾病过程还需要进行临床遗传学分析。因此作者接下来就在一定数量的病人标本中分析circANRIL与临床症状之间的对应关系。作者利用冠状动脉造影技术分析患者冠状动脉粥样硬化的程度。结果表明9p21相关的患者的circANRIL表达水平在外周血单个核细胞中明显增高（n=1933）。这一系列数据表明9p21，circANRIL表达增高以及CAD protection之间存在关联性。
图5 定量PCR 分析circANRIL表达量与临床症状的对应关系 （来自(Holdt et al., 2016)）A：Protective; H. heterozygote; G. risk
circANRIL是否发挥生物学功能是作者接下来需要回答的基本问题。作者首先构建了过表达载体，作者构建该载体的策略是在外显子5的上游及外显子7的下游各延长140bp进行克隆表达，最终在HEK-293细胞中鉴定到过表达的克隆，过表达效率平均约16倍。作者挑选了过表达效率在3倍左右的克隆，以模拟接近生理状态的水平。作者也用放线菌素D抑制RNA聚合酶II的活性，看RNA降解的速率，结果表明circANRIL要比线性的ANRIL的RNA稳定得多。过表达circANRIL后细胞凋亡增多，增殖减慢，而对照的circHPRT1过表达后则没有这方面的影响。RNA干扰circANRIL后凋亡减少和增殖增多。
图6 过表达circANRIL可促进细胞凋亡，抑制细胞增殖 （来自(Holdt et al., 2016)）
由于环状RNA表达量本身就非常低，RNA干扰实验可能会存在渗漏表达的情况，虽然在PCR实验中检测到，但依然不能完全排除极低含量的circANRIL存在并干扰实验结果的可能性，因此，为了更严谨的证明circANRIL的功能，作者进行了CRISPR/Cas-9基因打靶，得到了不同纯合型或杂合型的ANRIL基因外显子5-20敲除的HEK-293细胞株。这些细胞株细胞凋亡和增殖实验的结果与RNA干扰circANRIL的结果相同。而在这些敲除克隆中过表达circANRIL则能大大提高细胞凋亡的活力，抑制自爆增殖。但这些实验体系中线性RNA均同时因为敲除外显子5-20而被沉默。这一系列实验有力的证明了circANRIL在调控细胞凋亡和增殖过程中的作用。
图7 ANRIL基因打靶实验 （来自(Holdt et al., 2016)）
a. Cas-9打靶模式图；
b. 打靶效率鉴定；
c. 敲除外显子5-20后细胞凋亡检测；
d. 敲除外显子5-20后细胞增殖检测；
e. 敲除外显子5-20后过表达circANRIL细胞凋亡检测；
f. 敲除外显子5-20后过表达circANRIL细胞增殖检测。
有文献报道表明ANRIL基因可能会影响CDKN2A和CDKN2B基因，于是作者进一步分析了circANRIL对它们的影响情况。作者首先排除了circANRIL影响线性linANRIL的可能性，然后在过表达circANRIL的细胞中分析CDKN2A和CDKN2B基因的表达量，结果表明circANRIL过表达并不影响CDKN2A和CDKN2B基因的表达。预测分析表明circANRIL存在三个可能的miRNA结合位点，但过表达circANRIL并不影响这些microRNA的表达。circANRIL也不结合AGO2，因此可以排除circANRIL作为miRNA sponge功能的可能。
图8 circANRIL不影响CDKN2A和CDKN2B基因表达，也通过结合microRNA起作用。（来自(Holdt et al., 2016)）
线性的linANRIL是可以结合蛋白的，于是作者设计了一系列实验分析circANRIL结合蛋白的情况。作者构建了携带BoxB元件的过表达载体，BoxB元件可以结合-N-peptide，从而可以利用免疫沉淀的方法实现circANRIL相互作用蛋白的钓取和蛋白质组学分析。作者将BoxB元件构建到外显子6中。
图9 circANRIL结合蛋白分析实验过表达载体构建 （来自(Holdt et al., 2016)）
过表达后BoxB元件可以稳定的存在于环状RNA中，作者也利用定量PCR的实验验证了免疫沉淀过程中目标环状RNA被富集的情况。利用免疫沉淀的方法分离与circANRIL相互作用的蛋白，需要排除非特异性的结合的情况，作者选择了不带BoxB的过表达circANRIL细胞裂解体系做对照，可直接排除N非特异性结合的蛋白。
图10 circANRIL相互作用蛋白分析技术体系（来自(Holdt et al., 2016)）
利用该实验体系，作者鉴定到32个互作蛋白，主要的是核糖体相关蛋白（12种），还有RNA加工相关的蛋白（5种）。依据聚类分析的结果，作者推断circANRIL可能与核糖体生成及RNA加工过程有关。与circANRIL作用力最强的是NOP14和PES1，两者分别在核仁中参与40S和60S核糖体亚基的组装合成过程，其中PES1所在的复合体PeBoW负责了47S核糖体RNA前体加工成28S rRNA和5.8S rRNA的过程。此外，BOP1、BRIX1和NOLC1也都在钓取到的互作蛋白中。作者也利用RIP实验反向验证了几个蛋白与circANRIL相互作用的可重现性，结果表明PES1是几个蛋白中作用最强的。BoxB标记的circANRIL进行RNA Pull-down后Western实验也证明了确实与PES1有相互作用，但NOP1没有检测到。
图11 circANRIL相互作用蛋白 （来自(Holdt et al., 2016)）
左：几个核糖体生成相关的蛋白在互作蛋白中的分布；
中：RIP实验结果；
右：Western鉴定PES1。
PES1在rRNA加工过程中主要负责从36S中间体体加工为32S中间体直至形成成熟的18S rRNA的过程。
图12 哺乳动物核糖体RNA加工过程示意图 （来自(Holdt et al., 2016)）
如果PES1受到抑制，就会导致36S和32S两个中间体RNA的积累。于是作者利用QPCR实验分析了过表达circANRIL后36S和32S两种中间体rRNA的含量变化，以47S和7SL为为对照， circHPRT1为非特异性circRNA对照。结果如预期，36S和32S两个中间体在过表达circANRIL后明显增多，RNA干扰circANRIL后则减少。进一步说明circANRIL通过与PES1相互作用抑制后者的功能。
图13 过表达或敲低circANRIL后不同rRNA中间体含量变化 （来自(Holdt et al., 2016)）
核糖体生成如果收到抑制，会导致核仁压力，表现为核仁增多，体积变小。于是作者利用免疫荧光检测了PES1，过表达circANRIL后核仁明显变多，体积变小，但在Vector对照以及circHPRT1非特异性对照中均没有明显变化。这说明过表达circANRIL可导致核仁压力。
图14 过表达circANRIL导致核仁压力 （来自(Holdt et al., 2016)）
作者还观察到过表达circANRIL会导致p53入核，这在接下来的脉冲标记定量蛋白组学分析（Pulse SILAC）及转录组学分析中也得到了证实。
图15 过表达circANRIL后激活p53 （来自(Holdt et al., 2016)）
作者发现circANRIL和rRNA之间存在一定的序列同源性。由于circANRIL和rRNA前体和中间体RNA均可结合在PES1蛋白上，有没有可能这两种RNA分子之间会存在相同的结合位点，从而存在竞争性结合PES1的关系？ 作者选择了两种算法验证了circANRIL结合PES1的区域与rRNA中间体存在同源性。PES1的N-端和C-端结构域可能是它们相互做作用的区域。
图16 circANRIL与rRNA成熟中间体存在序列同源性，可竞争性结合PES1（来自(Holdt et al., 2016)）
为进一步验证该假设，作者构建了不同的PES1截短型突变体，结果表明只有当PES1蛋白存在C-端的446–588位氨基酸时，才能检测到与circANRIL存在相互作用，而该区域正是rRNA加工中间体RNA 分子结合的区域。
图17 PES1蛋白截短型突变分析（来自(Holdt et al., 2016)）
e. 截短型PES1免疫沉淀分析circANRIL结合情况；
f. g. 截短型PES1免疫沉淀分析rRNA中间体结合情况；
h. 过表达各种截短型PES1对p53激活情况影响；
i. 过表达各种截短型PES1对细胞凋亡的影响；
j. 过表达各种截短型PES1对细胞增殖的影响。
ANRIL基因在进化中并不保守，外显子5-7仅仅在灵长类中相对保守。由于circANRIL在小鼠中没有检测到，因此作者采用了人原代SMC细胞以及通过iPS诱导分化获得的巨噬细胞分析了circANRIL的功能。结果表明，SMC中过表达circANRIL可引起核仁压力，表现为核仁增多，体积变小，rRNA前体分子积累。过表达circANRIL可促进细胞凋亡，增殖减缓。
图18 过表达circANRIL对人原代SMC的影响（来自(Holdt et al., 2016)）
a.过表达circANRIL导致核仁增多，体积减小；
b.核仁数目统计；
c.核仁体积统计；
d.过表达circANRIL导致rRNA加工中间体36S和32S RNA增多；
f.过表达circANRIL诱导细胞凋亡；
g.过表达circANRIL抑制细胞增殖；
h.circANRIL表达量与细胞凋亡的关系；
i.circANRIL表达量与细胞增殖的关系；
j.iPS分化获得的巨噬细胞中过表达circANRIL导致rRNA前体分子聚集；
k.iPS分化获得的巨噬细胞中过表达circANRIL导致细胞凋亡增多；
l.临床中9p21相关个体中32S rRNA中间体含量分析；
本文揭示了一种全新的环状RNA功能形式：竞争性抑制rRNA加工中间体RNA分子结合到PES1蛋白中，从而影响rRNA的加工成熟，进而影响核糖体生成并导致核仁压力。所做的研究工作非常严谨细致，为探索环状RNA生物学功能的各位同仁提供了非常有价值的学习资料。
参考文献：
Holdt, L.M., Stahringer, A., Sass, K., Pichler, G., Kulak, N.A., Wilfert, W., Kohlmaier, A., Herbst, A., Northoff, B.H., Nicolaou, A., et al. (2016). Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans. Nat Commun 7, 12429.
文 | circRNA 吉赛生物
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