摘要
骨髓中的髓系祖细胞产生单核细胞，巨噬细胞，粒细胞和大多数树突状细胞。即使这些先天免疫细胞属于同一谱系，每种细胞类型在组织发育，宿主防御和适应性免疫的产生中也发挥着特定而关键的作用。过去已经开发出从骨髓细胞分化出髓系细胞的方案，以进行功能研究，并加深我们对它们对哺乳动物生理学贡献的理解。在该protocol中，我们描述了一种简单快速的方法，可从mouse骨髓中分离出单核细胞，将其培养长达5天，最后将它们分化为源自骨髓的巨噬细胞（图1）。
图形摘要：
技术方案亮点：
1）直接离心取骨髓，不用反复冲洗。
2）单核与巨噬细胞的培养与分化
1.实验概述：鼠单核细胞和巨噬细胞培养的步骤
背景
造血系统的先天免疫细胞构成了髓系细胞，例如单核细胞，巨噬细胞，粒细胞以及大多数树突状细胞（DC）。这些细胞是感染或组织损伤的主要传感器，并通过抗原呈递，启动淋巴细胞和细胞因子产生，为适应性免疫提供了桥梁。
单核细胞在巡逻组织、重塑局部微环境并在特定条件下呈递抗原的能力表现出显着的可塑性。这些细胞可以在持续的组织停留后分化为DC或巨噬细胞亚群（Davies和Gordon，2005）。另一方面，巨噬细胞从卵黄囊来源或造血祖细胞或单核细胞发育而来，对器官发育和体内平衡至关重要（Francke et al。，2011）。
为了研究原代细胞中的髓系细胞生物学，研究人员开发了几种方案，可以直接从原代组织中分离单核细胞或巨噬细胞，或从造血祖细胞中产生骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）。BMDM可以培养维持数天，并且可以通过在含有M-CSF / CSF1的培养基中培养分离出的骨髓来生成（Freund et al。，2020; Geissmann et al。，2010; Helft et al。，2015年）。树突状细胞（DC）可以通过在含有GM-CSF / CSF2或FLT3L的培养基中分化来产生。尽管两个系统都产生了髓系和DC亚群的混合细胞群，但FLT3L允许分化产生多个生理相关的亚群，如浆细胞样DC（pDC），CD8 和CD8 - DC（Jakubzick，2017; Naik，2005 ）。
我们的protocol描述了如何从骨髓中分离单核细胞，并培养和维持这些细胞数天的方案。此外，我们描述了一种从分离的胫骨和股骨中分离出总骨髓的快速方法，可实现最大程度的细胞恢复和存活。我们的技术克服了BMDM培养需要特定条件培养基（例如从L929细胞）的确定，并缩短了通过抽吸或冲洗来收集骨髓的漫长过程。
综上所述，这些技术方案可实现骨髓的快速，简单分离，并为高产率的培养原代单核细胞和巨噬细胞提供了基础，这对于下游研究如基因编辑，功能基因组学或过继性细胞转移是一个重大利好（Zhang et al，2008）。
材料和试剂
1. 细胞刮板
2. 70 µm尼龙无菌细胞过滤器
3. G18针
4. 0.5 ml微量离心管
5. 1.5 ml微量离心管
6. 50 ml离心管
7. 未经组织培养处理的6孔板
8. 血移液器
9. 低附粘附板培养皿
10. DMEM高葡萄糖培养基
11. EasySep单核细胞分选试剂盒（Stemcell Technologies，目录号：19861）
12. 双抗青霉素/链霉素
13. 重组鼠巨噬细胞集落刺激因子（rmM-CSF）
14. GlutaMAX
15. 胎牛血清（FCS）
16. 氯化铵钾（ACK）裂解缓冲液
17. 无菌PBS
18. 重组鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）
19. 重组鼠白细胞介素4（rmIL-4）
20. 巨噬细胞培养基
设备
1. 移液器
2. 台式离心机
3. 微量离心机
4. 37°C的水浴
5. 层流罩
6. 细胞培养箱
7. 无菌剪刀
8. 无菌钳
实验步骤
A. 骨髓提取（图2）
1. 使用机构批准的协议对小鼠实施安乐死。
2. 使用无菌镊子和剪刀分离股骨和胫骨。
3. 去除残留在骨骼上的肌肉或组织。
4. 将分离的骨头浸泡6孔板的PBS中，置于冰上，直至进一步处理。
5. 将G 18针推入0.5 ml微量离心管的底部，产生一个小孔。
6. 将0.5 ml微量离心管放在更大的1.5 ml微量离心管中。
7. 小心地将切断两端的股骨和胫骨（最多1个股骨和2个胫骨）放入嵌套在1.5 ml试管中的0.5 ml微量离心管中，然后盖上盖子。
8. 将试管以10,000 ×g离心30 s。
9. 丢弃装有骨头的0.5 ml微量离心管，他们应该没有骨髓。
10. 将获得的骨髓重悬于1 ml ACK裂解缓冲液中，并在室温下孵育2分钟。
11. 将0.70 µm无菌过滤器放在50 ml Falcon管中。
12. 将骨髓悬浮液过滤到试管中，并用10 ml PBS洗涤过滤器。
13. 添加额外体积的30 ml PBS冲洗滤器；丢弃过滤器。
14. 盖上管盖并以350 ×g离心4分钟。
15. 轻轻倒出以除去PBS，保留骨髓沉淀。
16. 如果需要，通过轻轻地重悬沉淀来重复PBS洗涤。
17. 对分离的骨髓细胞进行计数。
图2.骨髓分离步骤的实验轮廓
B. 单核细胞的分离和培养
1. 骨髓分离后，根据生产商的说明，使用Easysep单核细胞分离试剂盒分选富集单核细胞。
2. 分离的单核细胞可以在补充有5 ng / ml rmGM-CSF和2.5 ng / ml rmIL-4的巨噬细胞培养基中培养最多5天。单核细胞应以1×106细胞的密度以2 ml终体积接种在未经组织培养的6孔板中。
3. 如果需要，可以在第5天对Ly6C阳性，F4 / 80阴性，MHCII阴性和CD11c阴性的单核细胞进行分选（图3）。
图3.新鲜分离和培养的单核细胞的流式细胞仪分析。
新鲜分离和培养的单核细胞的Ly6C，F4 / 80，CD11b和IA / IE的表面标志物表达实例。单核细胞被鉴定为Ly6C高，F4 / 80低，MHCII低和CD11c低。
C． 分化为骨髓源性巨噬细胞（BMDM）
1. 添加50 ng / ml rmM-CSF到巨噬细胞培养基，并在水浴中预热至37°C。
2. 在20 ml巨噬细胞培养基中悬浮12×106分离的总骨髓细胞（来自过程A）或富集的单核细胞（过程B），接种于15 cm非组织培养处理的培养皿中。
3. 将培养皿置于细胞培养箱中，37°C和5％CO2，共培养5天。
4. 在第3天，添加20 ml新鲜补充的巨噬细胞培养基，不用去除原始培养基。
5. 在第5天，在显微镜下确认分化的BMDM的贴壁性。通过流式细胞仪评估分化效率（图4）。
图4.骨髓来源的巨噬细胞的单核细胞的流式细胞仪分析（第5天）。
分化的静息巨噬细胞可鉴定为Ly6C低，F4 / 80高，CD11c低和I-A / I-E低。
6. 对于下游分析，请去除培养基，并用20 ml无菌PBS中轻轻洗涤第5天的细胞。加入5 ml巨噬细胞培养基，使用细胞刮刀小心地将细胞从培养皿上刮下。如果需要，用另外的5 ml巨噬细胞培养基洗涤培养皿以收集更多的细胞。
7. 计数收集的细胞，并以所需的细胞密度（典型密度为0.5 x 106细胞/ ml）重悬于补充有50 ng / ml rmM-CSF的巨噬细胞培养基中。将细胞接种到所需规格的经组织培养处理的培养皿上。
8. 如果需要的话，在第5天，可以通过分选Ly6C低，F4 / 80高，CD11c低和I-A / I-E低的细胞，富集静息期的巨噬细胞。
培养基配方
1. 巨噬细胞培养基：DMEM高葡萄糖培养基10％FBS1×GlutaMAX1×青霉素/链霉素
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